重组HMGB1 对DEN2 感染Ana-1 细胞分泌TNF-α 及NO 的影响①

孙 伟 商正玲 左 丽 龙世棋 孟庆红 王 琨 尹 科

(贵阳医学院免疫学教研室，贵阳医学院干细胞与组织工程中心，贵阳 550004)

登革病毒(Dengue virus，DENV)属黄病毒科黄病毒属，是单链正义RNA 病毒。该病毒主要以白纹伊蚊或埃及伊蚊为传播媒介，感染人体后可引起临床症状不等的登革热(Dengue fever，DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome，DSS)，目前尚无有效疫苗和特异性方法治疗预防该疾病［1］。研究表明DENV 感染后引发不同程度的炎症或免疫功能紊乱与疾病的严重程度密切相关，而宿主的单核巨噬细胞(MΦ)既是DENV 感染的主要靶细胞也是机体抗DENV 感染的重要效应细胞，探讨体内不同免疫分子对DENV 感染的单核巨噬细胞生物功能的影响对于该疾病的转归具有重要的研究意义。

高迁移率族蛋白1(High mobility group box protein1，HMGB1)是一组保守非组核蛋白。近年来，经宿主细胞被动释放或主动释放的胞外HMGB1 被认为是一种重要的免疫分子，其在败血症、类风湿关节炎、Ⅰ型糖尿病、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)等疾病中发挥调控炎症的分子机制逐渐被关注［2］。许多研究表明单核巨噬细胞是体内胞外HMGB1 来源的重要细胞之一，该分子对DENV 感染MΦ 细胞的调控作用鲜见报道［3］。本研究以鼠源单核巨噬细胞Ana-1 为研究对象，初步探索rHMGB1 对DEN 感染靶细胞后的病毒增殖及炎症因子分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 重组HMGB1 蛋白(Sigma 公司);TNF-α ELISA 检测试剂盒(eBioscience 公司);FITC标记兔抗DENV-2 包膜(E)蛋白单克隆抗体(上海亿欣生物科技有限公司);H-DMEM 培养基、RMPI1640培养基、100 U/ml青-链霉素(HyClone 公司);TRIzol Reagent、M-MLV 第一链试剂盒、Premix ExTaq version 2.0 试剂盒(Invitrogen 公司);Griess试剂［1%对氨基苯磺酸、0.1%N-(N)乙二胺、5%磷酸，使用前临时配制］。

1.2 细胞株 白纹伊蚊细胞株(C6/36)和小鼠单核巨噬细胞系Ana-1，分别以H-DMEM 培养基和RPMI1640 培养基按常规方法培养及保存。

1.3 DEN2 NCG 株 购于中国预防医学科学院流行病研究所，乳鼠鼠脑常规传代保存。以C6/36 细胞增殖，病毒液经TCID50 法滴定病毒效价，小管分装，-80℃保存备用。DEN2 感染Ana-1 细胞后TRIzol 法提取细胞总RNA，逆转录使用M-MLV 第一链合成试剂盒操作说明完成RT-PCR。对DENV2 NS5部分基因序列进行Q-PCR 扩增，NS5 引物:上游:5-CATCACTGCCACCCAGAAGA-3;下 游:5-TGAAGTCGCAGGAGACAACC-3。PCR 产物为177 bp，GAPDH 作为内参基因，引物序列为:上游:5-CATCACTGCCACCCAGAAGA-3;下游:5-TGAAGTCGCAGGAGACAACC-3;Q-PCR 反应条件为:变性94℃30 s，退火64℃45 s，延伸72℃60 s。2-ΔΔCt法进行病毒增殖相对定量分析。

1.4 rHMGB1 干预实验 对数生长期的Ana-1 细胞以5 ×105/孔接种于6 孔培养板，DEN2 以MOI(感染复数)2∶1比例感染细胞。37℃共孵育2 h 后弃上清，1 ml PBS 洗涤3 次，加入含不同浓度重组HMGB1 的1 ml 维持液，其浓度分别为0、1、10、100、1 000 ng/ml，分别命名为DEN2 组、D-HMGB1-1 组、D-HMGB1-10 组、D-HMGB1-100 组、D-HMGB1-1000组同时设Ana-1 细胞空白对照。上述各组均设复孔。直接免疫荧光法(DIF)判定鉴定DEN2 是否感染Ana-1 细胞，具体操作如下:取1～2 滴感染细胞悬液滴于玻片上，设未感染对照。甲醛熏蒸固定，滴加含FITC 标记的抗E 蛋白抗体(1∶100)、0.02%伊文斯兰的PBS 混合(98 μl PBS+1 μl 抗体+1 μl伊文斯兰)。置37℃水浴箱，避光孵育1 h。PBS 液洗涤3 次，滴加封片剂。荧光显微镜观察结果。

1.5 ELISA 法检测 收集各实验组Ana-1 细胞培养上清，按试剂说明书进行操作。所测细胞因子为TNF-α。

1.6 Griess 法检测 收集的各实验组Ana-1 细胞培养上清进行Griess 试剂比色法检测。主要操作步骤如下:将亚硝酸钠标准品稀释成不同浓度，分别为0、10、25、50、75 μmol/L，1 mmol/L。100 μl 标准品及待测样品中，加入100 μl 新鲜配制的Griess 试剂，充分混合，室温放置10min 。选取波长为450 nm 处，酶标仪检测各空吸光值。

2 结果

2.1 直接免疫荧光法鉴定DEN2 感染Ana-1 细胞荧光显微镜观察显示DEN2 感染组24 h 的Ana-1发绿色荧光，而未感染组未见荧光现象(见图1)。说明DEN2 可黏附Ana-1。

图1 直接免疫荧光法鉴定DEN2 感染Ana-1 细胞(×200)Fig.1 Direct immunofluorescent (DIF)identification of Ana-1 adhered with DEN2(×200)

2.2 RT-PCR 鉴定DEN2 感染Ana-1 细胞 感染24 h 提取细胞总RNA，进行DEN2 NS5 基因RT-PCR 扩增，凝胶成像显示见图2。3 号泳道(DEN2 感染Ana-1 细胞组)可见明亮的条带。与预期的PCR 产物为177 bp 大小相符。而在1 号(水为模板对照组)和2号(正常Ana-1 细胞对照组)泳道未出现条带。

2.3 不同浓度rHMGB1 抑制DEN2 感染Ana-1 细胞病毒增殖 见图3、表1。Q-PCR 检测各组DEN2 NS5 基因表达水平，计算不同浓度rHMGB1 对病毒增殖抑制率影响，计算公式为:(rHMGB1 处理组的病毒载量/DEN2 组病毒载量)×100%，表1 显示rHMGB1 可抑制Ana-1 细胞胞内DEN2 的复制，并随着rHMGB1 浓度增高，抑制作用越明显，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

图2 RT-PCR 鉴定Ana-1 细胞中DEN2 NS5 基因Fig.2 Identification of DEN2 NS5 gene in Ana-1 cell by RT-PCR

2.4 不同浓度重组HMGB1 对DEN2 感染Ana-1 细胞分泌TNF-α 的影响 如图4 所示:不同浓度rHMGB1 对未感染DEN2 的Ana-1 细胞分泌TNF-α 与对照组相比，DEN2 感染后细胞分泌TNF-α 的水平明显增高，而加入rHMGB1 干预后细胞分泌TNF-α的水平明显增加，且与rHMGB1 浓度成正相关;与DEN2 组相比，D-HMGB 组分泌TNF-α 的水平有所减少，且rHMGB1 浓度越高，其分泌量越少。

2.5 不同浓度rHMGB1 对DEN2 感染Ana-1 细胞分泌NO 的影响 见图5、表2。如表2 所示，与空白对照组相比，DEN2 组分泌NO 的水平明显增高，各rHMGB1 刺激组分泌NO 的水平也有所增高，且与rHMGB1 浓度成正相关;与DEN2 组相比，各DHMGB1 组分泌NO 的水平有所降低，且与rHMGB1浓度成负相关。

表1 不同剂量rHMGB1 处理后DEN2 感染Ana-1 细胞中病毒载量的变化(±s，n=3)Tab.1 Expressional level of DEN2 NS5 gene in Ana-1 cell treated by different concentration of rHMGB1(±s，n=3)

表1 不同剂量rHMGB1 处理后DEN2 感染Ana-1 细胞中病毒载量的变化(±s，n=3)Tab.1 Expressional level of DEN2 NS5 gene in Ana-1 cell treated by different concentration of rHMGB1(±s，n=3)

Note:The different concentration of HMGB1 infected groups compared with control groups，1)P ＜0.05.

图3 不同剂量rHMGB1 处理后DEN2 感染Ana-1 细胞中病毒载量的变化Fig.3 Expressional level of DEN2 NS5 gene in Ana-1 cell treated by different concentration of rHMGB1

图4 不同浓度rHMGB1 处理后DEN2 感染Ana-1 细胞分泌TNF-α 情况Fig.4 TNF-α secreted for Ana-1 infected DEN2 treated with different concentration of rHMGB1

表2 rHMGB1 对DEN2 感染Ana-1 细胞分泌NO 的影响(±s，n=3，μmol/L)Tab.2 NO secretion level of DEN2 infected Ana-1 cell treated by different concentration of rHMGB1(±s，n=3，μmol/L)

表2 rHMGB1 对DEN2 感染Ana-1 细胞分泌NO 的影响(±s，n=3，μmol/L)Tab.2 NO secretion level of DEN2 infected Ana-1 cell treated by different concentration of rHMGB1(±s，n=3，μmol/L)

Note:HMGB1-10，HMGB1-100，HMGB1-1000 group compared with Control，1)P ＜0.05;DEN2 group compared with Control，2)P ＜0.05;D-HMGB1-1，D-HMGB1-10，D-HMGB1-100，D-HMGB1-1000 group compared with DEN2 group，3)P ＜0.05.

图5 不同浓度rHMGB1 处理后DEN2 感染Ana-1 细胞分泌NO 情况Fig.5 NO secreted for Ana-1 infected DEN2 treated with different concentration of rHMGB1

3 讨论

HMGB1 是细胞内保守的高迁移率蛋白家族成员。研究发现无论免疫细胞或非免疫细胞在多种刺激条件下，胞内HMGB1 可通过主动或被动方式从核内逐步释放到胞外，被认为是一种新型的内源性PAMP，而巨噬细胞是体内释放HMGB1 的重要细胞来源之一［4］。释放到胞外的HMGB1 可与巨噬细胞表面RAGE、TLR2、TLR4 等受体结合，通过NF-кB、NRF2 和CEBP 等信号通路发挥一系列下游生物学反应，参与机体固有免疫应答及适应性免疫应答［5］，在多种以炎症损伤为主的感染性和非感染性疾病中的生物功能逐渐被重视［6］。单核巨噬细胞既是DENV 感染的重要靶细胞，也是抗DENV 的重要效应细胞，病毒感染后炎性因子的异常分泌与DHF/DSS 等严重炎症损伤密切相关。本研究利用rHMGB1 体外观察其对DEN2 在细胞内增殖作用及细胞因子分泌的影响进行初步探讨。

本结果显示，在无DENV2 感染条件下，不同剂量的胞外rHMGB1 单纯刺激Ana-1 细胞分泌TNF-α水平无显著性差异。若在MOI=2 条件下预先用病毒感染细胞2 h 后，加入外源rHMGB1，检测感染24 h，Ana-1 细胞分泌TNF-α 的水平，发现随rHMGB1剂量增加而分泌量降低，且具有统计学意义。感染前后胞外HMGB1 对细胞分泌TNF-α 的作用不同，说明HMGB1 对体外DEN2 感染小鼠来源的巨噬细胞具有调控作用。结合病毒复制结果，提示随着胞外HMGB1 增加，胞内病毒复制显著减少(见表1)与DEN2 组相比，D-HMGB1 组TNF-α 分泌水平降低(P ＜0.05，)，说明HMGB1 可调节DEN 感染后TNF-α 的分泌，并随着rHMGB1 浓度的升高其调节作用越明显，但其作用机制尚不十分清楚。这与Edwin 等［7］的研究结果一致。

据报道，NO 可加重病毒感染后的病理表现;本研究结果显示，与对照组相比，DEN 组分泌NO 水平明显增加，rHMGB1 组分泌NO 水平有所升高;R Chakraborty 等人研究发现，巨噬细胞与rHMGB1 和LPS 或者PGN 共孵育可引起对iNOS 和NO 的协同表达，这是由于上调巨噬细胞表面受体(TLR2，TLR4 和RAGE)反过来放大MAPKs 和NF-κB 的活化，最后导致iNOS 和NO 的产量增加［8］。上述资料提示rHMGB1 可刺激巨噬细胞分泌NO，但在本研究中各个D-HMGB1 处理组NO 随着rHMGB1 浓度的升高，其分泌量逐渐减少，研究结果提示HMGB1 对DEN2 感染后所致巨噬细胞大量分泌NO 有一定调节作用;本研究还发现NO 分泌量与DEN 核酸水平成正相关，而NO 分泌量又与DEN 感染性疾病的病理表现密切相关，该现象的分子机制还需进一步研究。

综上所述，rHMGB1 对DEN2 在Ana-1 细胞内的复制有一定抑制作用，并且随着rHMGB1 浓度增加，其抑制率越明显，而TNF-α 及NO 分泌水平相应减少。提示HMGB1 对于DEN2 感染具有抑制作用，且可调节DEN2 感染所致大量炎症因子的分泌，一定程度降低机体的病理反应，有利于组织损伤的修复，对于病毒免疫方面的研究具有重要的价值。

［1］Sun P，Kochel TJ.The battle between infection and host immune responses of dengue virus and its implication in dengue disease pathogenesis［J］.Scientific World J，2013:843469.doi:10.1155/2013/843469.

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［6］Li W，Wang H，Ward MF，et al.Potential role of high mobility group box 1 in viral infectious diseases［J］.Viral Immunol，2006，19(1):3-9.

［7］Edwin Kamau，Ratree Takhampunya，Tao Li，et al.Dengue virus infection promotes translocation of high mobility group box 1 protein from the nucleus to the cytosol in dendritic cells，upregulates cytokine production and modulates virus replication［J］.J General Virol，2009，90(4):1827-1835.

［8］Chakraborty R，Bhatt KH，Sodhi A.High mobility group box 1 protein synergizes with lipopolysaccharide and peptidoglycan for nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages in vitro［J］.Mol Immunol，2013，54(1):48-57.