NMF308nmf／nmf小鼠耳蜗毛细胞凋亡方式及z-VAD-FMK对毛细胞的保护作用△

李胜利 王玉虎 张敏燕 李白芽 郑庆印 朱雯瑾 朱宏亮

NMF308nmf／nmf小鼠耳蜗毛细胞凋亡方式及z-VAD-FMK对毛细胞的保护作用△

李胜利1，2，3王玉虎1＃张敏燕3李白芽3郑庆印3朱雯瑾2朱宏亮2

目的 了解年龄相关性听力损失小鼠耳蜗毛细胞的凋亡方式，探讨半胱氨酸蛋白酶（caspase）抑制剂z-VAD-FMK［z-Val-Ala-Asp（Ome）-fluoromethylketone］防治老年性聋的效果。方法 选用新生NMF308nmf／nmf小鼠14只和成年同窝NMF308nmf／nmf小鼠32只，分为新生小鼠腹腔注射组（14只）、成年小鼠腹腔注射组（14只）和成年小鼠圆窗膜注射组（18只），各组又分为治疗组（注射z-VAD-FMK）和对照组［注射二甲基亚枫（dimethylsulfoxide，DMSO）］，采用圆窗膜局部和腹腔注射两种方法给药，给药前后行ABR检测，用免疫荧光染色化学技术TUNEL、caspase-3和PI（碘化丙啶）染色标记耳蜗毛细胞，观察各组耳蜗毛细胞的凋亡和存活状况。结果NMF308nmf／nmf小鼠从1月龄开始发生听力减退和毛细胞功能改变，到2月龄时，caspase-3激活表达的毛细胞凋亡现象是毛细胞凋亡出现的最早表现；TUNEL阳性标记特征稍晚出现；PI标记可见毛细胞细胞核固缩和碎片出现的时间从2月龄开始；到3月龄时该种小鼠听力基本丧失，耳蜗毛细胞严重缺失；而应用z-VAD-FMK治疗后，各治疗组小鼠ABR反应阈明显好于对照组；耳蜗毛细胞凋亡数目较对照组减少，存活数明显较对照组多，尤以圆窗膜注射组明显。结论 NMF308nmf／nmf小鼠耳蜗毛细胞的死亡方式以caspase-3凋亡途径为主，应用caspase-3抑制剂z-VAD-FMK定向内耳给药，可以阻断caspase-3信号途径激活所导致的毛细胞凋亡，从而有效防治老年性聋。

老年性聋； 外毛细胞； 凋亡； 抗凋亡抑制剂； 动物模型

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20141231.1128.008.html

随年龄增加氧化损伤主要造成耳蜗细胞损伤，并加速耳蜗细胞凋亡［1，2］。已证明caspase-3在老年豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞中呈阳性表达，提示caspase-3在豚鼠耳蜗老化过程中起重要作用［3］。活性氧代谢物是正常氧化磷酸化过程的副产物，由于在机体老化过程中长期慢性活性氧代谢物的作用及清除自由基酶活性的下降，使耳蜗细胞线粒体损伤及ATP合成减少，激活半胱氨酸蛋白酶（caspases），并启动细胞凋亡程序。年龄相关性听力损失（age-related hearing loss，AHL）NMF308nmf／nmf小鼠早期耳蜗毛细胞首先出现DNA单链断裂，随后caspase-3信号途径激活，导致耳蜗毛细胞凋亡，这是老年性聋的主要分子机制之一［4，5］。国外研究也发现caspases激活是导致哺乳类动物耳蜗毛细胞死亡的重要途径［6］。caspase抑制剂z-VADFMK［z-Val-Ala-Asp（Ome）-fluoromethylketone，Z-VAD-FMK］是一种可以穿透细胞膜的泛caspase抑制剂（cell permeable pan caspase inhibitor），可以抑制由caspase激活导致的细胞凋亡。对氨基糖苷类抗生素耳中毒鸡使用z-VADFMK治疗后，显示其可保护鸡内耳前庭毛细胞的存活，减少毛细胞的凋亡［7］。耳蜗局部应用线粒体毒性3-NP酸造成耳蜗侧壁纤维化退变导致听力丧失豚鼠，用z-VAD-FMK治疗可明显抑制耳蜗基底回侧壁的纤维化退变的程度［6］。最近研究证明，体外培养应用caspase抑制剂能够有效治疗快速毛细胞死亡造成的年龄相关性听力损失［8］，但目前尚未见到在体应用caspase抑制剂防治老年性聋耳蜗毛细胞凋亡的报道。本研究旨在探讨NMF308nmf／nmf小鼠耳蜗毛细胞的凋亡方式，并比较NMF308nmf／nmf新生和成年小鼠局部和全身应用caspase抑制剂z-VAD-FMK治疗毛细胞凋亡的效果，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 实验动物用美国俄亥俄州克里夫兰市西储地大学（Case Western Reserve U-niversity，Cleveland）的NMF308小鼠46只，它是由乙酰基亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）神经科学诱变（Neuroscience Mutagenesis Facility，NMF）产生的突变鼠，表型呈快速渐进性听力损失，命名为NMF308nmf／nmf，可作为年龄相关听力损失的动物模型［4，5］。动物分组及处理方法见表1。

表1 实验动物分组、处理方法

1.2 圆窗膜给药方法 成年NMF308nmf／nmf小鼠用Avertin（0.5 mg／g）麻醉后腹腔麻醉，从颈部正面腹侧切开，钝性分离并暴露一侧听泡，在手术显微镜下，看到明显的听泡凸起骨壁，仔细止血，小线状刀在听泡骨壁切一小口，调整光线和颞骨位置，可明显看圆窗龛，用微量注射器将5μl caspase抑制剂z -VAD-FMK（治疗组）（z-VAD-FMK溶入二甲基甲砜（dimethylsulfoxide，DMSO）中，浓度为10 m M，ALEXIS Corporation）或DMSO（Sigma）（对照组）注射到圆窗膜上，保持位置不变1小时。随后封闭骨孔，缝合切口，消毒、包扎伤口。

1.3 腹腔注射方法 成年鼠和出生两天的NMF308nmf／nmf小鼠腹腔注射z-VAD-FMK（购于EMD Chemicals Inc，Germany，用0.2%DMSO稀释到100μM）（治疗组）或DMSO（对照组）。按15 mg／kg剂量腹腔注射，每天一次，连续注射10 d。

1.4 ABR检测方法 用美国Inteligent Hearing Smart听觉诱发电位—耳声发射仪检测。分别检测各组动物click声和tone burst声诱发的ABR反应阈。动物用Avertin（0.5mg／g）麻醉后，用针电极插入颅顶为记录电极，同侧为参考电极，对侧接地。刺激率19.1次／秒，高通300 Hz，低通3 000 Hz，平均叠加256～512次，以波Ⅲ出现为标志判断ABR反应阈值［9］。

1.5 耳蜗铺片及毛细胞计数 各组动物检测ABR完成后，在麻醉状态下，快速断头，迅速取出颞骨，分离出耳蜗，在解剖显微镜下，用纤细钢针在耳蜗尖钻一小孔，关键是将前庭膜挑破，再挑破圆窗膜和卵圆窗膜，并在耳蜗底回骨隆起出钻一小孔，看到外淋巴液溢出。马上用细的滴管吸取1.0%的硝酸银溶液，从蜗尖的小孔和两窗及底回的小孔反复灌入。用双蒸馏水洗涤数次，再灌入10%的福尔马林固定。在日光下曝光2～4 h。在解剖显微镜下分离、铺片，对铺片完整的样品进行毛细胞计数［8］。

1.6 TUNEL和PI染色标定方法 耳蜗样本快速用4%多聚甲醛固定（ACROS，New Jersey，USA），在4℃冰箱过夜。在解剖显微镜下，耳蜗置于中性磷酸盐缓冲液中（PBS），完整取出Corti器。Corti器置于0.5%Triton X-100孵育15 min（室温），PBS洗两遍。加100μl TUNEL反应混合液d UTP和Td T于Corti器管中，在37℃避光的暗盒中孵育60分钟。随后，洗涤两次，再置于PI染色液中（2～5μg／ml Propidium iodine PI in PBS）室温共30 min。最后，Corti器分回平铺于载玻片上，加抗猝灭剂，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。

1.7 耳蜗超薄切片观察 动物在Avertin（0.5 mg／g）腹腔麻醉后，快速取下双侧听泡，用纤细钢针挑破圆窗和卵圆窗膜，迅速给耳蜗灌入2.5%的戊二醛溶液（Electron Microscopy Sciences），用0.1 M磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS，p H 7.4）配制，反复灌注三次。4℃固定四小时后，在解剖显微镜下分离出完整的Corti器，用120 m M EDTA脱钙1～1.5小时。用0.1 M PBS洗涤三次后，置入1%锇酸（osmium tetroxide，Electron Microscopy Sciences）后固定1小时。随后梯度酒精脱水，临界点干燥，塑料包埋，半薄切片，美兰染色光镜观察定位后，再行超薄切片，用日立7100透射电镜（Hitachi，Tokyo，Japan）观察。

1.8 统计学方法 采用Microsoft Office Excel录入数据，计算平均值，制作数据表格。所有数据用SPSS10.0 for Window软件进行统计学显著性检验。组间比较采用q检验（Newman-keuls）。

2 结果

2.1 各组动物ABR反应阈 成年小鼠圆窗膜注射给药后，治疗组较对照组ABR反应阈值降低10～25 dB；圆窗膜给药后的38～52天，治疗组ABR反应阈较对照组下降超过20 dB，而在给药后59 d和64 d，两组间16和32 k Hz的ABR阈值差异不明显。

新生小鼠腹腔注射后27、33、38、45、52和59天可见z-VAD-FMK治疗组ABR反应阈各频率ABR反应阈值均明显下降。

成年小鼠腹腔注射后，治疗组在34～41天的ABR反应阈值较对照组有一定程度下降，但到48天时，治疗组与对照组的ABR阈值差异无统计学意义。新生鼠腹腔注射组给药后59天、成年鼠腹腔注射组给药后58天及成年鼠圆窗注射组给药后54天的c ABR及tb ABR反应阈见表2。

表2 各组小鼠c ABR和tb ABR反应阈值（dB SPL，±s）

表2 各组小鼠c ABR和tb ABR反应阈值（dB SPL，±s）

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2.2 耳蜗外毛细胞计数结果 NMF308nmf／nmf突变鼠1月龄时耳蜗底回开始出现外毛细胞散在性缺失，2月龄时耳蜗底回80%OHCs丧失，3月龄时扩展到中回50%OHCs缺失，4月龄时耳蜗中回和基底回的OHCs几乎完全丧失（图1）。成年NMF308小鼠圆窗膜注射z-VAD-FMK后64天，顶回耳蜗毛细胞有少量缺失，而耳蜗中回、底回很少有毛细胞缺失，提示z-VAD-FMK耳蜗局部治疗能明显抑制毛细胞的凋亡。

成年NMF308小鼠腹腔注射z-VAD-FMK后64天，耳蜗基底回的外毛细胞消失较对照组轻度减少，但无显著性差异。新生小鼠腹腔注射z-VAD-FMK治疗组较对照组的耳蜗外毛细胞消失明显减少。

总体比较，z-VAD-FMK治疗可抑制耳蜗毛细胞的凋亡，圆窗膜途径治疗的效果最好，其次是新生小鼠早期接受腹腔注射z-VAD-FMK（图1）。

图1 给药64天后新生及成年小鼠治疗组耳蜗毛细胞消失率比较

2.3 NMF308小鼠OHCs的TUNEL和PI染色标记结果 NMF308小鼠在1月龄时最先出现耳蜗底回散在性TUNEL阳性标记的OHCs，核呈圆型，并有少量外毛细胞缺失，但未见OHCs核固缩细胞碎片，是毛细胞凋亡的早期阶段。3月龄时OHCs缺失十分严重，可见PI标记的核固缩和细胞碎片出现，同时TUNEL阳性标记的OHCs亦十分明显，是毛细胞凋亡的典型表现（图2）。

而成年NMF308小鼠圆窗膜注射z-VADFMK3个月后，耳蜗毛细胞的TUNEL阳性标记明显减少，毛细胞缺失数目亦减少，并且耳蜗毛细胞核的圆形程度亦明显改善（图3）；而对照组耳蜗毛细胞呈现广泛的TUNEL阳性标记，耳蜗中回的凋亡毛细胞较多，并出现毛细胞缺失（图3），说明z-VADFMK治疗明显的抑制了耳蜗毛细胞凋亡进程。

新生NMF308小鼠腹腔注射DMSO后64天，可见耳蜗外毛细胞消失从顶回向底回逐渐加重，顶回出现散在的外毛细胞消失，而底回出现成片的外毛细胞消失。TUNEL标记亦可见耳蜗外毛细胞从顶回向底回染色逐渐加重，PI标记的核DNA染色亦类似，TUNEL和PI的叠加显色（Merge）表现出从顶回向底回染色明显加重的现象（图4）。

图2 1月龄NMF308小鼠OHCs的TUNEL和PI染色标记结果

图3 成年NMF小鼠圆窗膜注射z-VAD-FMK 3个月后的耳蜗毛细胞凋亡标记

图4 新生NMF308nmf／nmf小鼠腹腔注射DMSO组耳蜗标本行TUNEL和PI标记染色结果

成年NMF308小鼠腹腔注射z-VAD-FMK后，耳蜗标本行TUNEL和PI标记染色，可见耳蜗外毛细胞消失从顶回向底回逐渐加重，耳蜗各回未出现散在的外毛细胞消失。TUNEL标记亦可见耳蜗外毛细胞从顶回向底回染色逐渐减轻，PI标记的核DNA染色亦类似，TUNEL和PI的叠加显色（Merge）表现出从顶回向底回染色明显加重的现象（图5）。

图5 成年NMF308小鼠腹腔注射z-VAD-FMK后耳蜗标本行TUNEL和PI标记染色结果

2.4 各组透射电镜观察结果 正常的耳蜗外毛细胞胞体呈长拄状，静纤毛束存在，细胞核呈饱满的圆形，核仁清晰而分散，细胞器大而多（图6a、c）。成年NMF308小鼠腹腔注射z-VAD-FMK后，耳蜗外毛细胞胞体和核均固缩，尤其是核固缩明显，静纤毛束消失（图6b）；内毛细胞表现较外毛细胞轻，静纤毛束均存在。新生NMF308小鼠腹腔注射z-VAD-FMK后，耳蜗内毛细胞胞体和核均固缩，尤其是核固缩明显（图6d）；而成年小鼠圆窗膜注射治疗组耳蜗内毛细胞胞体和核固缩均不明显（图6e）。

图6 透射电镜观察z-VAD-FMK治疗各组的内外毛细胞的超微结构改变

3 讨论

目前，老年性聋动物耳蜗毛细胞死亡的分子途径目前尚不十分清楚。因此探明控制耳蜗毛细胞死亡的分子机制，是发展新的预防和治疗耳聋策略的关键［15］。老年性聋患者的颞骨标本来源困难，而老年性聋动物模型因其生长期长，用形态学和免疫组织化学方法并不能完全确定耳蜗毛细胞死亡途径是坏死还是凋亡。因此，一些纯种系的动物因为具有快速老化的快速听力丧失，而作为老年性聋研究的动物模型［10，11］。最常用的是C57BL／6小鼠［12，13］，该种系小鼠耳蜗毛细胞在成年早期开始蜕变，随年龄增长，毛细胞从耳蜗基底回快速向蜗顶扩展，到26月龄时，几乎整个耳蜗的外毛细胞和大部分内毛细胞均丧失［14］，此特点符合感音性老年性听力损失耳蜗的变化规律。另一种具有快速渐进性年龄相关性听力损失的小鼠是Fischer 344（F344）小鼠，其耳蜗退变主要在血管纹、Corti器的盖膜以及螺旋唇和血管纹的明显胶原纤维化［15］，并在这些病变部位看到细胞凋亡现象［16］，已证明老年F344小鼠耳蜗外毛细胞凋亡是主要的死亡形式［17］。本实验用的NMF308nmf／nmf小鼠是典型的感音性老年性听力损失动物模型，耳蜗毛细胞的凋亡是导致其听力减退的主要原因。

衰老细胞线粒体DNA损伤、能量代谢障碍及自由基损伤导致其容易凋亡。活性氧代谢物是正常氧化磷酸化过程的副产物，由于在机体老化过程中长期慢性活性氧代谢物的作用及清除自由基酶活性的下降，使耳蜗细胞线粒体损伤及ATP合成减少，激活半胱氨酸蛋白酶（caspases），并启动细胞的凋亡程序。当细胞内ATP不足以提供凋亡所需能量时，细胞则以坏死方式死亡。年龄相关性的自由基致线粒体损伤及ATP合成减少的程度是老年耳蜗毛细胞选择不同死亡方式的关键因素［18］。凋亡精确的生化机制及其不同的信号转导途径的调控以及新的凋亡调控相关基因的发现，对老年性聋的防治都具有重要意义［19］。caspase激活是哺乳类动物耳蜗毛细胞死亡的重要分子途径。研究表明在鼠耳蜗具有增龄依赖的caspase-3激活导致的组织细胞凋亡的DNA碎片［20］。

本研究结果显示，TUNEL阳性染色和caspase -3标记凋亡OHC在时间和空间上不完全同步出现，说明凋亡的细胞信号转导过程是一个动态过程。老年性耳蜗毛细胞凋亡是一个缓慢、非一致性的改变过程［21］，老年性耳蜗毛细胞凋亡时空变化相对较慢，本研究中NMF308nmf／nmf小鼠在2月龄时才出现caspase-3标记凋亡的OHC，即说明了此点。而给新生NMF308nmf／nmf小鼠腹腔注射z-VAD-FMK 8～10天后，明显抑制了耳蜗毛细胞的凋亡，存活的毛细胞数目明显增多，听功能亦明显改善。

本研究在NMF308nmf／nmf鼠1月龄时，用TUNEL标记发现耳蜗毛细胞有较多出现特异的绿色标记，被标记的凋亡毛细胞核呈圆形，未见固缩核变形，说明此时是毛细胞凋亡的早期阶段。Taylor［22］用TUNEL标记卡那霉素损害7天的鼠耳蜗，仅看到一个内毛细胞呈现圆形的TUNEL阳性核。同样在老年耳蜗切片用TUNEL标记出现阳性染色的圆形细胞核［23］。噪声损害耳蜗后，所有TUNEL荧光染成绿色的阳性细胞核固缩，表明DNA断裂片段已经在这些凋亡的细胞里发生［24］。顺铂（cis-Diamminedichoroplatinum，CDDP）损害Corti器后在耳蜗铺片可见TUNEL标记的内外毛细胞核几乎全部呈圆形［25］。本文结果与上述研究完全相同。噪声暴露后，OHCs所有阳性标记的细胞核具有明显的核固缩，但TUNEL染色较弱，正常OHCs没有TUNEL染色且呈现正常的核形态，TUNEL染色标记在OHC已经固缩的核上，表明OHCs已进入快速的DNA碎片阶段［6］。而本研究仅在NMF308nmf／nmf小鼠3月龄后，观察到TUNEL阳性标记与PI重染现象，说明此时已是毛细胞凋亡的后期阶段；TUNEL与PI双染可以确定TUNEL染色阳性的细胞为凋亡的细胞。所以，本研究结果明确表明，年龄相关性听力损失小鼠随年龄增长出现耳蜗毛细胞凋亡，老年性聋小鼠耳蜗毛细胞的死亡是以DNA单链断裂开始导致毛细胞核凋亡为主，随后引起细胞浆caspase-3激活，发生凋亡的串式连锁反应，使耳蜗毛细胞以凋亡形式死亡，导致老年性聋的发生，这可能是老年性聋的分子机制之一。

caspase抑制剂以不可逆的方式作用于caspase活化点，从而抑制细胞凋亡。有文献［22］报导，在caspase-3水平上阻断细胞凋亡的通路可以有效地保护神经元和毛细胞。因此，可以考虑设计以caspase-3为靶标的治疗方案，从而阻断细胞凋亡的通路，达到保护毛细胞和神经元的目的，也许能为治疗噪声性聋开辟一条新的治疗途径奠定基础。本实验选用caspases-3抑制剂z-VAD-FMK通过对NMF308小鼠全身用药和耳蜗局部用药，观察z -VAD-FMK对老年性聋耳蜗毛细胞凋亡的抑制效果。结果显示，成年NMF308nmf／nmf小鼠应用z-VAD-FMK经圆窗膜途径治疗27～30天时，由于药物直接由圆窗膜渗透进入耳蜗的毛细胞部位，可有效、快速抑制处于早期凋亡过程的毛细胞死亡，其治疗效果较全身用药组明显，可作为今后老年性聋防治策略的研究方向之一。

（致谢：本研究得到美国Case Western Reserve University，Cleveland，耳鼻喉-头颈外科郑庆印实验室提供的动物和实验帮助。特此致谢！）

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（2014-04-16收稿）

（本文编辑 周涛）

RoIes of Caspase Inhibitors in CochIear Hair CeIIs SurvivaI and Preventing Age-ReIated Hearing Loss

Li ShengIi*，Wang Yuhu，Zhang Minyan，Li Baiya，Zheng Qingyin，Zhu Wenjin，Zhu HongIiang
（*Scientific Research Centre，the Second AffiIiated HospitaI，Medicine SchooI of Xi＇an Jiaotong University，Xi＇an，710004，China）

Objective In this study，we investigated the apoptosis of hair cell in the cochlea of age-related hearing loss（AHL）generated by ENU mutagenesis，and to study a pan caspase inhibitor（z-VAD-FMK）which is to protect the cochlea hair cells from hearing loss induced by age-related hearing loss（AHL）.Methods Through z -VAD-FMK intraperitoneal injection and round window membrane（RWM）drug were delivered into the Cdh23 nmf308 nmf／nmf mice 5（postnatal days 2-32）inner ear.ResuIts The results showed that the nmf308 mice with progressive hair cell loss along a base to apex gradient with age-related hearing loss.The cochlear OHCs reduced from 5%～10%at 1 month to 100%at 3 month in the basal region.Substantial amounts of TUNEL-positive OHCs nuclei appeared at 1 month age，and activated caspase-3 labeling demonstrated that most OHCs appeared at 2 months age.These suggested that DNA single strand break was attributed primarily to apoptosis of cochlear lesions，whereas in the later stage of lesion，the expansion led to activation of caspase-3 activity reduced with furtherprogression of nuclear condensation in age-related hearing loss.ConcIusion The addition of a pan caspase inhibitor（z-VAD-FMK）significantly protected the cochlea against the hair cell loss induced by apoptosis.Our study showed that aspase inhibitor，Z-VAD-FMK appeared to play a prominent role in age-related hearing loss mediated hair cell death loss induced by apoptosis.Our study showed that aspase inhibitor，Z-VAD-FMK appeared to play a prominent role in age-related hearing loss mediated hair cell death.

Presbycusis； Outer hair cell； Apoptosis； Caspase inhibitor； Animal model

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.01.013

时间：2014-12-31 11：28

R764.43+6

A

1006-7299（2015）01-0050-07

△ 国家自然科学基金对外交流与合作项目（30210103151）、国家自然科学基金项目（81170922）、美国NIH项目（R01DC007392）联合资助

1 西安交通大学第二附属医院科研中心实验室，药剂科（西安 710004）； 2 西安交通大学医学院神经科学研究中心； 3 Case Western Reserve University School of Medicine，Department of Otolaryngology Head＆Neck Surgery.Cleveland USA

李胜利，男，陕西人，副研究员，主要研究方向为听力学、内耳病理生理学和分子生物学、耳聋防治、毛细胞再生和凋亡。

李胜利（Email：lishengli59@163.com）＃为并列第一作者

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