短串联重复序列连锁分析进行产前诊断前母血污染鉴定的研究

张清健，郑立新，田佩玲，叶嘉玲，杨　卫，王柏贤，徐珊珊，周冰燚，蔡慧娜，方俊宇，朱志勇

(广东省计划生育科学技术研究所 生殖科，广东 广州510600)



短串联重复序列连锁分析进行产前诊断前母血污染鉴定的研究

张清健*，郑立新，田佩玲，叶嘉玲，杨卫，王柏贤，徐珊珊，周冰燚，蔡慧娜，方俊宇，朱志勇

(广东省计划生育科学技术研究所 生殖科，广东 广州510600)

摘要：目的建立一种简单易行，快速，准确的母血污染鉴定技术，应用于产前诊断前排除母血污染。方法在X染色体上选取具有高杂合度和高多态性的6个短串联重复序列位点，应用连锁分析对10例羊水和10例脐带血标本进行母血污染鉴定。结果在10例羊水和10例脐带血标本中各发现1例标本发生母血污染。结论该方法可应用于临床实验室进行产前诊断前排除母血污染。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0728)

临床上，用于遗传病产前诊断的羊水和脐带血标本，有时会在穿刺过程中受到母血的污染，可能产生错误的产前诊断结果而引起医疗纠纷。我们在X染色体上选取具有高杂合度和高多态性的6个位点(见表1)作为个体识别标志,采用多重PCR结合银染检测技术检测产前诊断前羊水和脐血是否存在母血污染，旨在建立一种简单易行、快速、准确的母血污染鉴定方法，现报告如下。

1材料与方法

1.1　对象

20例个体均遵照知情同意原则，采集其静脉血和羊水或脐带血标本。

1.2　方法

1.2.1双盲法处理标本收集标本的人员，用母血人为污染若干例羊水或脐血标本；而实验检测和分析人员并不知情。

1.2.2外周血、羊水细胞和脐血DNA的提取采用常规苯酚抽提法提取外周血DNA。

1.2.3PCR扩增在95℃3 min，95℃ 40 s，于相应的Tm进行退火35 s，72℃延伸35 s(时间可根据片段大小进行调整，具体引物序列及Tm值见表2)，30-33个循环，72℃总延伸8 min，4℃保存。变性聚丙烯酰胺凝胶电脉，银染法检测。

表1　6个微卫星位点详细情况

注：杂合度：表示在人群中，该等位基因位点为杂合的概率。杂合度高的位点有利于单体型分析，信息含量高。

表2　6个位点引物序列

2结果

2.1在10例脐血之母血污染检测图1所示3号脐血标本，从44CA、45CA和63CA明显可排出母血污染。图2所示6号发生污染，其余9例未发现母血污染，与预期结果相符。

图1　3号脐血标本检测结果，从44CA、45CA和63CA明显可排出母血污染

图2　从6个位点上可判断6号脐血标本发生了母血污染

2.2在10例羊水之母血污染检测10号发现存在母血污染，其余9例未发现母血污染；与预期结果相符(图3、图4)。

图3　9号羊水标本检测结果，从44CA、45 CA和49 CA可明显排除母血污染

图4　从6个位点上可判断10号羊水标本发生了母血污染

3讨论

Kleihaure抗酸染色法是鉴别母血与胎血的传统技术。此技术原理是有核红细胞中胎儿血红蛋白与成人血红蛋白之间结构上的差异导致胎儿血红蛋白比成人血红蛋白更能抵抗酸变性[1]。Kleihaure抗酸染色法广泛应用于母婴溶血、妊娠期间外伤及阴道出血等临床检测。其优点是操作简单，成本低廉；缺点是如果母体血液中HBF含量的异常升高(如镰状细胞病或部分β地中海贫血病)，染色过程中就会出现将母血误为胎儿血的错误结果。例如，在18例用Kleihaure抗酸染色技术鉴定实验中，Holcomb WL[2]等发现至少有2例将母血错误地鉴定为胎儿血。

流式细胞术是70年代初发展起来的一项高新技术，其工作原理是采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。流式细胞仪比Kleihaure抗酸染色法快速、灵敏和特异[3]；缺点是仪器价格昂贵，还要制备各种昂贵的抗体进行荧光染色，操作过程繁琐且技术要求高，因而难以普及。

短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点是人类基因组DNA中广泛存在的一类具有高度多态性和遗传稳定性的遗传标记。它是由2-6个碱基对组成的核心序列,经过几次到几十次串联重复,构成特定的DNA片段遗传标记，每个个体同一等位基因上这种系列重复次数不同，呈多态性并按孟德尔规律呈共显性遗传[4]。

在短串联重复序列中，小的变异几乎潜伏着无限等位基因的变异，鉴定这些变异，甚至在单个座位的基因型足可以鉴定一个个体，如有4个以上位点不排斥假设父亲时，一般父亲关系概率均在99.7%以上[5]，因而选取几个位点可作为一有效个体识别标志，具有极强的特异性；另外结合PCR技术，使得此技术具有极强的灵敏度，理论上羊水或脐带血标本只要含有一个母体有核细胞，就可以得到鉴别。我们选取具有高杂合度和高多态性的6个STR位点,应用多重PCR结合银染对10例羊水和10例脐血标本进行母血污染鉴定，结果与预期一致，准确可靠。此技术还具有操作简单，所需设备简便，成本低廉的优点。适宜在普通医院进行推广，具有广阔的应用前景。

参考文献：

[1]Martel-Petit V,Petit C,Marchang M.Use of the Kleihaure test to detect fetal erythroblasts in the maternal circulation[J].Prenat Diagn,2001,21(2):106.

[2]Holcomb WL，Gunderson E,Petrie RH.Clinical use of the Kleihaure-Betke test[J].Perinat Med,1990,18(5):331.

[3]Fernandes BJ,von Dadelszen P,Fazal,et al.Flow cytometric assessment of feto-maternal hemorrhage;a comparison with Betke-Kleihaure[J].Prenat Diagn,2007,27(7):641.

[4]Edwards AL,Civitello A.DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats[J].Am J Hum Genet,1991,49(4):746.

[5]周新,孙连名,吴健民，等.检验医学考核指南[M].第2版.武汉:湖北科学技术出版社，2004:386.

关键词：连锁分析；产前诊断；母血污染

Identification of maternal blood contamination before prenatal diagnosis with short tandem repeat sequences linkage analysisZHANGQing-jian,ZHENGLi-xin,TIANPei-ling,etal.(FamilyPlanningResearchInstituteofGuangDongProvince,Guangzhou510600，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a simple,rapid,accurate maternal blood contamination identification technology,used to exclude maternal blood contamination before prenatal diagnosis.Methods6 short tandem repeat loci on the X chromosome with high heterozygosity and polymorphism were selected to identify maternal blood contamination from 10 cases of amniotic fluid and 10 cases of umbilical cord blood specimens by linkageanalysis.ResultsIn 20 cases of samples,one case of amniotic fluid and one case of umbilical cord blood samples occurred in maternal blood contamination,respectively.And the experiment results agree with expected results.ConclusionThis method can be used to exclude maternal blood contamination before prenatal diagnosis in clinical laboratories.

Key words:linkage analysis;prenatal diagnosis;maternal blood contamination

(收稿日期：2014-12-16)

作者简介：张清健(1977-)，男，副主任技师，硕士，研究方向：生殖遗传学。

文献标识码：A

中图分类号：R714

文章编号：1007-4287(2015)05-0728-04

*通讯作者

基金项目：广东省计生委项目(编号：2009202)