KB-R7943对高脂饮食大鼠心肌离体缺血再灌注损伤的保护作用及机制

吕岩，吴楠，李雯娜，贾大林(中国医科大学附属第一医院，沈阳110001)

KB-R7943对高脂饮食大鼠心肌离体缺血再灌注损伤的保护作用及机制

吕岩，吴楠，李雯娜，贾大林
(中国医科大学附属第一医院，沈阳110001)

摘要:目的探讨选择性Na+/Ca2 +交换体反向转运抑制剂KB-R7943对高脂饮食大鼠心肌离体缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法大鼠心脏给予完全缺血30min，之后再灌注120min。其中正常饮食喂养大鼠12只为对照组(C组)，高胆固醇饮食喂养大鼠48只。缺血后高胆固醇饮食大鼠做如下处理: 12只不干预(高胆固醇对照组，HC组); 12只给予KB-R7943(KB组); 12只给予KB-R7943和ATP敏感性钾通道阻滞剂格列本脲(KB + G 组); 12只仅给予格列本脲(G组)。通过血流动力学指标评价心脏功能，2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色测量心肌梗死范围，电镜下观察心肌超微结构及TUNEL染色评价心肌细胞凋亡程度。结果高脂喂养后，大鼠血清TC、LDLC、HDL-C均升高。与HC组比较，其余各组HR均加快(P均＜0.05);与HC组再灌注5、30、120min比较，KB组左室发展压、等容收缩期左室压力上升的最大速率、等容舒张期左心室压力下降的最大速率均升高(P均＜0.05)。各组再灌注30min内的各指标无统计学差异。C组心肌梗死程度明显低于HC组，KB组梗死程度最轻(P均＜0.05)。与C组比较，HC组TUNEL阳性心肌细胞所占百分比均高(P均＜0.05)，KB组明显低于HC、KB + G组、G 组(P均＜0.05)。HC组、KB + G组及G组心肌纤维排列紊乱，Z线扭曲，肌带长短不一。肌细胞核形状不规则，核心内异染色质凝聚，核膜局部模糊。KB组少数肌丝灶性溶解，线粒体肿胀轻微，少许肌浆网扩张。结论高胆固醇血症可增加缺血心肌的损伤程度，但不影响心脏收缩功能; KB-R7943通过ATP敏感性钾通阻滞剂减少高脂饮食大鼠缺血心肌坏死及细胞凋亡，从而减轻缺血再灌注损伤。

关键词:缺血再灌注损伤;高脂血症;细胞凋亡; Na+/Ca2 +交换体反向转运抑制剂;大鼠

心肌缺血再灌注(I/R)后Na+/Ca2 +交换体(NCX)反向转运的激活加重钙超载是心肌I/R损伤的重要机制［1］，通过抑制NCX来减轻I/R时的钙超载是减轻I/R的有效途径。KB-R7943是一种新型的NCX反向转运抑制剂。既往一些研究证实，KB-R7943能够减少心肌缺血后酶的释放［2，3］，减轻心肌梗死程度以及致命性的再灌注损伤［4～6］，模拟缺血后处理的作用。但在高脂条件下它是否还能发挥这样的作用仍未见有研究证实。2013年1月～2014年4月，我们对此进行了相关探讨。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料60只Wistar雄性大鼠，4周龄，体质量90～100 g，饮食良好，均由中国医科大学实验动物部提供，按照美国国立卫生研究院《实验动物管理与使用指南》［7］标准喂养。主要试剂及仪器: HDL、LDL检测试剂盒(迈克科技有限公司，四川)，TC酶法试剂盒(BHKD，北京)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma，美国)，TUNEL反应混合液(Calbiochem，美国)，KB-R7943(TOCRIS，英国)，格列本脲(Sigma，美国)。Langendorff离体心脏灌流系统(PL3508B2，埃德仪器国际贸易公司)，BIOPACmP150生理记录仪(Biopac公司，美国)，透射电镜(JEM-1200EX，日本)。

1.2动物分组及I/R损伤高脂动物模型制备60 只Wistar雄性大鼠中，12只正常饲养(普通饲料喂养8周，体质量300～350 g)(C组)。另外48只给予高脂饮食(高脂饲料喂养8周，体质量350～450 g)，平均分为高胆固醇对照组(HC组)、KB-R7943 组(KB组)、KB-R7943和ATP敏感性钾通道(KATP)阻滞剂格列本脲组(KB + G组)、格列本脲组(G组)。全部大鼠心脏给予30min完全缺血，之后再灌注120min，高脂喂养的各组大鼠分别给予后处理: HC组单纯缺血后再灌注; KB组缺血后再灌注前加入1 μmol/L KB-R7943; KB + G组缺血后再灌注前加入1 μmol/L KB-R7943 +0.3 μmol/L格列

本脲; G组缺血后再灌注前给予格列本脲0.3 μmol/ L再灌注。I/R高脂动物模型制备过程:经尾静脉给予肝素200 U，腹腔注射致死量(100mg/kg)的苯巴比妥麻醉大鼠，迅速分离心脏并置于肝素化的KH液中。将心脏悬挂于Langendorff灌流装置上，经主动脉逆行插管，37℃恒温、流量1.5 L/min的95% O2/5% CO2充分饱和、37℃恒温的K-H液灌流，心脏置于37℃恒温瓶中，剪去左心耳，左室置入注水球囊测定灌流压力，保持其为75mmHg，球囊充水，连接压力传感器。20min后待左室压力及灌流量稳定，进行下一步试验。

1.3大鼠血脂、血流动力学指标的测定分别于喂养前及取心脏前采血，用酶法测TC，PTA-Mg2 +沉淀法测HDL-C、LDL-C。血流动力学指标包括:心率(HR)、等容收缩期左心室压力上升的最大速率(+dp/dt)、等容舒张期左心室压力下降的最大速率(－dp/dt)、左心室发展压(LVDP)，通过BIOPACmP150生理记录仪进行分析。

1.4大鼠心肌梗死程度、细胞凋亡程度的观察每组选3只大鼠，将左心室切片进行TTC染色。计算未染色部分质量占左室总质量的百分比。每组选3只大鼠心脏组织制作石蜡切片，每只随机选取3张切片进行TUNEL染色，光镜下分析结果。每张切片在显微镜下选10个区域，计算每个区域的总细胞数及TUNEL阳性细胞数。

1.5大鼠心肌超微结构观察每组选取3只大鼠，取其心脏，左室负染色法染色后通过透射电镜观察心肌纤维及线粒体结构。

1.6统计学方法采用SPSS14.0统计软件。计量资料以±s表示，高脂喂养大鼠喂养前后血脂的比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析;计数资料以百分比表示，比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1高脂喂养前后大鼠血清TC、LDL-C、HDL-C水平比较高脂喂养前TC、HDL-C、LDL-C分别为(68.6±10.5)、(47.6±7.2)、(13.7±0.5)mg，高脂喂养后分别为(106.1±3.6)、(55.8±13.0)、(25.2±1.3)mg。高脂喂养前后比较，P均＜0.05。

2.2各组血流动力学指标比较见表1。

2.3各组心肌梗死范围比较C组、HC组、KB组、KB + G组、G组心肌梗死范围分别为(35.0± 5.0)%、(46.0±8.7)%、(28.6±3.3)%、(42.8± 5.1)%、(47.0±8.5)%。与C组比较，HC组心肌梗死范围大、KB组心肌梗死范围小;与HC组比较，KB组心肌梗死范围小(P均＜0.05)。

表1　各组血流动力学指标比较()

表1　各组血流动力学指标比较()

注:与HC组同时间比较，*P＜0.05;与其他组同时间比较，#P＜0.05。

组别　n　HR LVDP(mmHg)+dp/dt　　－dp/dt C组33±4.3 1 284±114 1 179±134 12基线　183±23 86±6.4 2 322±233 1 416±222再灌注5min　170±14 34±5.4 1 589±103 1 178±178再灌注30min　174±19 38±5.1 1 622±208 1 222±117再灌注120min　160±18 34±3.2 1 362±198 1 238±156 KB组　12基线　175±12 83±6.6 2 472±274 1 408±190再灌注5min　176±22 45±7.9*1 946±202*1 689±312*再灌注30min　178±27 47±6.0*2 066±287*1 608±202*再灌注120min　158±22 40±3.4*1 754±203*1 556±234*KB +G组　12基线　160±18 88±7.5 2 231±262 1 400±156再灌注5min　148±16 31±8.4 1 489±301 1 176±232再灌注30min　146±12 34±5.7 1 584±211 1 298±345再灌注120min　126±17 30±4.9 1 335±158 1 278±198 G组　12基线　155±16 84±6.9 2 330±198 1 401±165再灌注5min　155±12 34±6.7 1 476±225 1 188±198再灌注30min　160±15 39±4.2 1 601±201 1 274±237再灌注120min　126±21 34±3.4 1 378±167 1 256±159 HC组　12基线　157±20#82±7.3 2 318±187 1 378±107再灌注5min　148±15#32±7.7 1 466±259 1 109±167再灌注30min　155±23#38±6.5 1 589±217 1 271±189再灌注120min　125±26#

2.4各组心肌细胞凋亡程度比较C组、HC组、KB组、KB + G组、G组TUNEL阳性心肌细胞所占百分比分别为(7.1±1.4)%、(14.8±3.0)%、(5.4±1.5)%、(13.1±1.7)%、(13.9±1.5)%，与C组比较，HC组、KB + G组、G组均高(P均＜0.05);与HC组比较，KB组低(P均＜0.05)。

2.5各组心肌超微结构比较C组心肌细胞可见心肌纤维排列不规则，部分有断裂、缺如，Z线扭曲，肌节长短不一，肌细胞肿胀。KB + G组、G组、HC组心肌纤维排列紊乱，Z线扭曲，肌节长短不一。肌细胞核形状不规则，核内异染色质凝聚、边集，核膜局部模糊。相邻肌纤维间多数线粒体嵴减少明显或近空泡化。KB组肌细胞结构正常，肌节清楚，少数肌丝灶性溶解，心肌纤维排列较整齐，部分有断裂、缺如，Z线、M线清晰，相邻肌纤维间有较多的线粒体，线粒体基质密度较高。

3　讨论

心肌梗死是指局部心肌急性供血不足导致心肌组织坏死，是发达国家中最主要致死性疾病。发生急性心肌缺血后尽早恢复缺血区的血液灌注是阻止心肌细胞死亡的最有效途径，然而心肌缺血后再灌

注本身会加重缺血后心肌细胞损伤，即发生I/R损伤。引起心肌I/R损伤机制的相关研究有很多，目前比较公认的机制有氧自由基的激活、钙超载、细胞能量代谢障碍、血管内皮细胞功能异常、细胞凋亡以及NO合成和释放减少，如何针对这些I/R后出现的心肌损害因素做出相应的处理来减少甚至消除I/R损伤是目前研究的热点问题，但迄今为止仍没有能够应用于临床的切实有效减轻I/R损伤的方法或药物。有报道显示，饮食所致的高脂血症能够通过增加氧化应激、炎症反应、血管阻塞、细胞凋亡及抑制NO合成来加重心肌损伤;但也有部分研究报道，高脂血症对心肌I/R损伤有保护作用［8，9］。

目前针对高脂动物模型心肌I/R损伤的研究存在很多争议，造成这些不同结论的原因很多，如持续缺血时间、年龄、性别、种属不同等。本研究中HC组心肌梗死程度增加，HR减低，但各组再灌注30min内的+dp/dt、-dp/dt、LVDP无统计学差异，提示高脂血症并不影响心肌收缩功能，这与既往的研究［10］结果相同。

心肌I/R损伤中心肌细胞钙超载是重要的机制，而心肌细胞NCX在钙超载的发生发展中起了至关重要作用。在I/R时，Ca2 +通过NCX反向转运的激活进入细胞内是钙超载的重要途径［11］。KBR7943是一种选择性NCX反向转运抑制剂，能够通过抑制Ca2 +内流减轻胞质和线粒体内钙超载，减少心肌细胞坏死。在本研究中KB组心肌梗死范围较HC组明显降低，证实KB-R7943在高脂条件下有减轻心肌坏死的作用。

在I/R的信号通路中，表面受体、线粒体KATP、自由基、蛋白激酶C起着关键作用。正常条件下，KATP通道处于关闭失活状态。心肌缺血时，细胞内ATP浓度下降，缺血代谢产物(ADP、乳酸、H+)积聚，KATP通道开放，导致K+外向复极电流增加，细胞膜通透性增加，心肌细胞动作电位时程缩短，电压依赖性钙电流及心肌收缩力减弱，减少了ATP的消耗，在心肌缺血时发挥保护作用［12，13］。KB-R7943可以减少心肌缺血后的梗死程度，而格列本脲能够消除KB-R7943的这种保护作用，提示KATP通道在其心肌保护作用中发挥重要作用。我们前期研究［6］也证实NCX抑制剂与KATP通道开放剂合用能够进一步缩小心肌梗死范围，这种作用可能是进一步激活了线粒体KATP通道实现的。

总之，饮食诱导的高胆固醇血症增加缺血心肌的损伤程度，但不影响心脏收缩功能，增加细胞凋亡是其加重心肌I/R损伤的途径之一，选择性NCX反向转运抑制剂KB-R7943通过KATP通道减少高脂动物缺血心肌坏死及细胞的凋亡，从而减轻I/R损伤。本研究的不足之处在于Langendorff模型作为离体模型，脱离了体内血浆蛋白、血细胞以及激素的影响，所以这些结果应用于临床尚需进一步的在体研究证实。

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文章编号:1002-266X(2015)37-0026-03

文献标志码:A

中图分类号:R542.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.008