多囊卵巢综合征痰湿证患者血清代谢组学分析及其生物标志物筛选

李修阳，张宁，任健，徐琬梨，李毓秋，刘家义(山东中医药大学，济南250355)

多囊卵巢综合征痰湿证患者血清代谢组学分析及其生物标志物筛选

李修阳，张宁，任健，徐琬梨，李毓秋，刘家义(山东中医药大学，济南250355)

摘要:目的应用基于核磁共振的代谢组学方法研究多囊卵巢综合征(PCOS)痰湿证患者和健康人的血清代谢物的差异，探讨与PCOS痰湿证相关的生物标志物及其发病机制。方法对收集到的PCOS痰湿证患者、健康人临床血清样本进行核磁共振氢谱预处理，随后使用SIMCA-P +软件进行模式识别多变量分析。经主成分分析法、偏最小二乘法-判别分析方法分析数据后，再经正交偏最小二乘法-判别分析进行修正，通过分析组间的差异代谢成分，最终筛选鉴定出PCOS痰湿证的生物标志物。结果PCOS痰湿证患者和健康人之间的血清代谢成分存在差异。PCOS痰湿证患者较健康人血清中降低的代谢物有1-甲基组氨酸、柠檬酸、乙醇、甘油磷酸胆碱、低密度脂蛋白L1、脂质L6(P＜0.05)，增加的有乙酰乙酸、极低密度脂蛋白L5、脂质L7、乳酸、赖氨酸、N-乙酰糖蛋白、苏氨酸(P＜0.05)。结论上述13种代谢物可能是PCOS痰湿证潜在的生物标志物。PCOS痰湿证患者血清代谢组分的变化机制和三羧酸循环、糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢密切相关，主要表现为三羧酸循环障碍、糖代谢缓慢、脂肪动员加强。

关键词:多囊卵巢综合征;代谢组学;痰湿证;生物标志物

Metabonomic analysis and biomarker screening of serum for polycystic ovary syndrome patients with phlegm-dampness syndrome

LI Xiu-yang，ZHANG Ning，REN Jian，XU Wan-li，LI Yu-qiu，LIU Jia-yi
(Shandong University of Traditional Chinesemedicine，Jinan 250355，China)

Abstract:ObjectiveTo study thedifferences in the serummetabolites for polycystic ovary syndrome(PCOS)between patients with phlegm-dampness syndrome and healthy people with the application ofmetabonomics based on nuclearmagnetic resonance(NMR)，and to investigate the biomarkers associated with phlegm-dampness syndrome of PCOS as well as themechanism.Methods After the preparation of clinical serum samples collected from PCOS patients with phlegmdampness syndrome(phlegm-dampness syndrome group，n =20)and the healthy people(control group，n =20)，we preprocessed the hydrogen spectrum for nuclearmagnetic resonance，then using SIMCA-P + software for pattern recognition ofmultivariate analysis.After thedata were analyzed by the principal component analysis(PCA)and partial least squaresdiscriminant analysis(PLS-DA)，then they were amended by the orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis(OPLS-DA).According to the analysis ofdifferentmetabolic components，the biomarkers of phlegm-dampness syndrome of PCOS were finally screened and identified.Results There were significantdifferences in the serummetabolites between the phlegm-dampness syndrome group and the control group.The levels of 1-methyl histidine，citrate，ethanol，glycerol phosphate choline，lowdensity lipoprotein L1 and lipid L6 were lower in the phlegm-dampness syndrome group as compared with those of the control group，and statistically significantdifference was found(all P＜0.05).And the levels of acetoacetate，very lowdensity lipoprotein L5，lipid L7，lactate，lysine，n-acetyl glycoprotein and threonine were higher in the phlegm-dampness syndrome group as compared with those of the control group，and statistically significantdifference was found between the two groups(all P＜0.05).Conclusions These 13metabolites could be the potential biomarkers for PCOS patients with phlegm-dampness syndrome.The changemechanism of serummetabolites in PCOS patients was closely

related with the tricarboxylic acid cycle，glucosemetabolism，lipidmetabolism and proteinmetabolism，whichmainlymanifested thedisorders of tricarboxylic acid cycle，slowed glucosemetabolism and increased lipid and proteinmetabolism.

Key words:polycystic ovary syndrome;metabonomics; phlegm-dampness syndrome; biomarker

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期妇女常见的一种复杂的内分泌及代谢紊乱疾病，具有高度异质性，主要临床表现为月经失调、不孕、多毛和痤疮，并伴有排卵功能紊乱和高雄激素血症，发病率高达12%，是引起不排卵性不孕的主要原因。目前其发病机制尚不明确。作为系统生物学研究的关键技术和方法，代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，它通过系统研究代谢产物的变化规律，越过体内复杂的调控过程来揭示生命活动的代谢本质。代谢组学技术主要用于临床诊断疾病和药物的药理毒理研究，其中在临床疾病诊断方面，通过检测分析代谢产物中与疾病相关的“生物标志物”进而建立疾病的代谢诊断模型。目前其已广泛运用到很多疾病的诊断中，如冠心病、糖尿病、肿瘤等［1，2］。笔者所在课题组在2013 年3～11月探讨了其在筛选PCOS痰湿证患者血清相关生物标志物中的应用。

1　资料与方法

1.1临床资料所选患者均来自于山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心，正常对照组来源于因男方因素就诊的健康家属。PCOS痰湿证患者20例(PCOS痰湿证组)，年龄(31.25±1.78)岁;正常对照组20例，年龄(29.88±2.96)岁，两组年龄差异无统计学意义(P＞0.05)。PCOS诊断标准:根据欧洲人类生殖协会和美国生殖医学协会于2003年在鹿特丹联合(发起)制定的标准［3］:①稀发排卵和(或)无排卵;②临床和(或)生化指标提示存在雄激素增多症，并排除先天性肾上腺增生、分泌雄激素肿瘤和库欣综合征等可能致病的因素。雄激素增多症的临床表现包括痤疮、多毛、秃顶;③卵巢多囊性改变:包括一侧或双侧卵巢有≥12个直径在2～9mm的小卵泡，和(或)卵巢体积增大＞10 cm3。以上三项具备任意两项及以上者即可诊断为PCOS。痰湿证诊断标准:根据新世纪全国高等中医院校教材第七版《中医妇科学》［4］及《中药新药临床研究指导原则》中医证候的临床研究指导原则拟定。主症:①月经周期延后，经量少，经色淡红，质黏腻如痰;②逐渐闭经;③婚久不孕。兼症:①胸腹痞满;②易恶心呕吐;③形体肥胖;④舌淡胖或有齿印，苔腻;⑤脉滑或弦滑。具备主症中的1项及兼症中的3项，即可诊断。

1.2样本采集入选病例严格按诊断标准执行，嘱所有受试者实验前停服影响生殖内分泌及代谢的药物3个月以上，于早卵泡期(月经3～4d)或闭经期(B超下无优势卵泡)禁食8～12 h后，由专业护士抽取空腹静脉血，离心后分离血清，置－80℃冰箱保存。所有受试者采集完后的血清标本按组编号，且与调查表的编号完全统一。

1.3血清样本处理在进行核磁共振测试前，将保存于低温冰箱的血清样本取出并于室温下解冻，取400 μL样品于1.5mL离心管中，先后加入30 μL缓冲液(600mmol/L PB溶液、pH =7.4、总体积20mL，K2HPO4和NaH2PO4摩尔比为4∶1，取2.213 0 g K2HPO4·3H2O 和0.378 2 g NaH2PO4·2H2O，用重水定容至20mL)和170 μL重水(D2O)，涡旋混匀1min，然后以4℃、12 000 r/min离心10min，取上清500 μL置于直径5mm的核磁共振管中，用于检测。

1.4血清样本中生物代谢产物的检测实验所用仪器是Varian 600谱仪，将装有样品的核磁共振管放入核磁共振波谱仪，然后进行匀场锁场。在参数设置上，选择在Varian 600型核磁共振波谱仪上用ID探头采用CPMG脉冲序列进行测试，1H共振频率599.91mHz，采样延迟2.1 s，采集时间0.998 4 s，谱宽8 012.8 Hz，测试温度为25℃，总回波时间100ms，累加次数128次。收集的所有样本的血清测试，都在统一的参数设置、逐一参数调整后进行。1.5生物代谢产物的主成分分析(PCA)使用SIMCA-P +软件(V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden)对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，PCA使用中心化换算的数据标度换算方式。

1.6生物代谢产物的偏最小二乘法—判别分析(PLS-DA)及模型的验证使用SIMCA-P +软件(V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden)对归一化后的数据进行PLS，发现NMR数据(X变量)和其他变量(Y变量，分组信息)之间的相关关系。PLS-DA使用自适换算的数据标度换算方式。PLS-DA对模型的质量用10折血清交叉验证法进行检验，并用交叉验证后得到的R2X和Q2(分别代表模型可解释的变量和模型的可预测度)对模型有效性进行评判。在此之后，通过排列实验随机多次(n =200)改变分类变量y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值对模型有效性做进一步的检验。

1.7生物代谢产物的正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)使用SIMCA-P +软件(V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden)进行OPLS-DA，最大化地凸

显模型内部两组间的差异。OPLS-DA使用自适换算的数据标度换算方式。

2　结果

2.1生物代谢产物的PCA分析结果见图1。

图1　两组血清图1H-NMR谱(CPMG脉冲序列)的PCA得分图

2.2生物代谢产物的PLS-DA及对模型的验证结果见图2。

图2　两组血清样本间PLS-DA排列检验图

2.3生物代谢产物的OPLS-DA结果见图3。

2.4两组生物代谢产物的差异通过对OPLS-DA及各代谢物相应的相关系数的分析，对有统计意义的代谢物进行进一步归纳。在相关系数图(图3)中，将每一个变量的loading值与其标准偏差的平方根值相乘后进行数据的回溯转换。然后与相应的相关系数临界值表进行比对，得到引起组间差异的代谢物。结果显示，PCOS痰湿证组和正常对照组之间的血清代谢成分存在差异。见表1。PCOS痰湿证患者较健康人血清中降低的代谢物有1-甲基组氨酸、柠檬酸、乙醇、甘油磷酸胆碱、低密度脂蛋白L1、脂质L6(P均＜0.05)，增加的有乙酰乙酸、极低密度脂蛋白L5、脂质L7，乳酸、赖氨酸、N-乙酰糖蛋白、苏氨酸(P均＜0.05)。

图3　血清核磁共振氢谱的OPLS-DA评分图(左图)及组间比对得到的相应系数(右图)

3　讨论

1-甲基组氨酸、柠檬酸、乙醇、甘油磷酸胆碱L1、脂质L6较健康人低，乙酰乙酸、L5、脂质L7、乳酸、赖氨酸、N-乙酰糖蛋白、苏氨酸较健康人增加。提示以上13种代谢产物可能是PCOS痰湿证潜在的生物标志。其在PCOS痰湿证患者与正常对照组有统计学差异的血清代谢组分中，柠檬酸在PCOS痰湿证患者血清中的水平明显低于正常人，作为三羧酸循环(TCA)的重要中间代谢产物和起始产物，柠檬酸水平的降低说明机体伴随着TCA循环障碍。正常生理状态下，葡萄糖在无氧情况下，经糖酵解过

程分解成乳酸，并释放少量能量，乳酸是这一糖酵解过程的最终产物。结果显示PCOS痰湿证患者血清中乳酸含量较正常人高，说明在组织缺氧的状态下，PCOS痰湿证患者体内的糖酵解过程增强。此外，乳酸还是糖异生途径的代谢中间产物，也是糖异生过程的主要原料。人在某些生理病理情况下，肌糖原可生成大量乳酸，过多的乳酸经血液运到肝脏，再合成葡萄糖或糖原，可防止乳酸性酸中毒的发生。本实验中PCOS痰湿证患者血清乳酸水平的升高也说明其糖异生过程可能受到抑制。乙酰乙酸是酮体代谢的中间产物，正常情况下血中仅含少量酮体，在饥饿、糖尿病、高脂低糖膳食时，酮体生成增加，超过肝外组织利用酮体的能力时，导致血中酮体含量异常升高，并可引起代谢性酸中毒，治疗需纠正糖代谢紊乱，减少脂肪动员和酮体的生成。PCOS痰湿证患者血中乙酰乙酸升高说明其糖代谢缓慢，脂肪酸动员加强，这些表现与胰岛素抵抗导致的糖代谢异常有潜在联系。

表1　两组间血清代谢物的OPLS-DA相关系数

在脂代谢方面，PCOS痰湿证患者血清中L5较正常人升高。极低密度脂蛋白的代谢受饮食、激素等很多因素的调节，有研究［5］表明极低密度脂蛋白血浓度升高是胰岛素抵抗、脂代谢紊乱的主要特征，其升高与胰岛素抵抗密切相关。胰岛素是调节脂肪合成的主要激素，PCOS痰湿证患者的胰岛素抵抗可致胰岛素调节脂肪合成，造成极低密度脂蛋白的升高。低密度脂蛋白由极低密度脂蛋白转化而来，是仅含apoB-100的脂蛋白，携带胆固醇最多，也是正常人空腹时血浆中主要的脂蛋白。低密度脂蛋白代谢主要通过与受体结合后进入肝或肝外细胞。低密度脂蛋白的受体是一糖蛋白，且功能目前尚不明确，该受体可特异识别并结合含apo-100或apoE的脂蛋白。本研究中PCOS痰湿证患者血清中水平的变化与之前研究不同，其原因可能是PCOS痰湿证患者的胰岛素抵抗通过影响受体，加速在血中的清除速率，使其水平下降，这一推论有待于进一步深入研究。此外，相比正常人，PCOS痰湿证患者血清中脂质水平的升高或降低进一步提示其脂代谢紊乱。研究［6］表明肥胖PCOS患者具有更明显的脂代谢紊乱，可能与雄激素过多和胰岛素抵抗有关。

在氨基酸代谢方面，本实验发现1-甲基组氨酸在PCOS痰湿证患者血清中显著降低，许多氨基酸的碳架是三羧酸循环的中间产物，所以氨基酸含量的降低可能与三羧酸循环异常有关。氨基酸除能生成蛋白之外，也能通过脱氨基生成有机酸类物质，这些物质分解代谢后的产物以底物的形式参与三羧酸循环，产生并提供能量。苏氨酸分解后通过丙酮酸，进而生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环。PCOS痰湿证患者血清苏氨酸升高，说明其分解并生成乙酰辅酶A的过程受抑制，进一步提示三羧酸循环受损。Zhao等［7］也发现，PCOS患者伴随显著的三羧酸循环受损，并通过柠檬酸水平下降和血中苏氨酸等氨基酸水平的升高得以反映。赖氨酸与羟赖氨酸、色氨酸的分解代谢共同经α-酮己二酸脱羧基最后氧化成乙酰辅酶A进入三羧酸循环，这个过程发生的代谢异常统称为赖氨酸代谢异常。PCOS痰湿证患者血清赖氨酸水平升高提示其代谢过程可能受到抑制，进而生成乙酰辅酶A减少，最终导致三羧酸循环障碍。另外，和其他生糖氨基酸一样，赖氨酸也有较强的刺激胰岛素分泌的作用，因此，PCOS痰湿证患者的高赖氨酸血症可能是其高胰岛素血症的原因之一。

综上所述，PCOS痰湿证患者血清代谢组分的变化和三羧酸循环、糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢密切相关，主要表现为三羧酸循环障碍、糖代谢缓慢、脂肪动员加强。提示PCOS痰湿证患者存在显著的糖脂代谢紊乱，胰岛素抵抗可能与此有潜在联系。

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收稿日期:( 2015-07-08)

通信作者简介:刘家义(1952-)，男，教授，博士生导师，主要研究方向为舌、脉、证及其相关性研究。E-mail: liujiayi0202@163.com

作者简介:第一李修阳(1984-)，男，讲师，主要研究方向为舌、脉、证及其相关性研究。E-mail: Jack092284@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81273667);国家自然科学基金青年科学基金资助项目(81102560)。

文章编号:1002-266X(2015)37-0015-04

文献标志码:A

中图分类号:R711.75

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.005