AG490对大鼠脑缺血损伤的保护作用及其机制

高延才，杜爱玲，张林朋，张合鹏，曹少鹏，王振刚，季泰令(潍坊医学院，山东潍坊6053;潍坊医学院附属医院)

AG490对大鼠脑缺血损伤的保护作用及其机制

高延才1，杜爱玲2，张林朋1，张合鹏1，曹少鹏1，王振刚2，季泰令2(1潍坊医学院，山东潍坊261053;2潍坊医学院附属医院)

摘要:目的研究JAK激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路的阻断剂AG490对大鼠脑缺血损伤的保护作用，并探讨其作用机制。方法用健康SD大鼠制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，随机分为四组:mCAO组、假手术组、高剂量AG490干预组和低剂量AG490干预组。MCAO组采用左侧颈外动脉插栓法造模;假手术组不插栓，结扎并剪断左侧颈外动脉，夹闭左侧颈总动脉1 h后撤动脉夹，缝皮;高剂量AG490干预组和低剂量AG490干预组在造模成功后1 h分别给予腹腔注射6、3mg/kg AG490，MCAO组和假手术组给予等量生理盐水。动物麻醉清醒后6、12、24 h，应用神经功能行为学评分评价脑缺血损伤程度;动物麻醉清醒后24 h用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色技术检测脑组织梗死范围，ELISA法检测脑组织内肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)水平。结果大鼠麻醉清醒后24 h，与假手术组比较，MCAO组、高剂量AG490干预组和低剂量AG490干预组神经功能行为学评分、TNF-α和IL-1β水平高，脑组织梗死范围大(P＜0.05或＜0.01);与MGAO组比较，高剂量AG490干预组、低剂量AG490干预组神经功能行为学评分低，TNF-α、IL-1β水平低，脑组织梗死范围小(P均＜0.01)。结论AG490对大鼠脑缺血损伤具有保护作用，其作用是通过抑制JAK/STAT信号传导通路、减轻炎症反应实现的。

关键词:脑缺血; AG490; JAK激酶;信号转导和转录激活因子;大鼠

脑血管病在人类各种疾病死因中一直位于前3位，成为人类死亡的主要原因。其中缺血性脑血管病(ICVD)临床较多见，约占全部脑血管病患者的85%，最为常见的是大脑中动脉栓塞(MCAO)引起的。由于大鼠的脑血管分布与人脑部血管类似，而且愈合能力强、易于饲养、便于操作，因此本实验采用了目前常见的大鼠MCAO模型。AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，是JAK激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路的阻断剂［1］。目前研究表明，JAK/STAT信号转导途径参与中枢神经系统的多个生物学分化过程，与脑外伤、脑肿瘤、免疫反应机制等相关［2］。2014年10月～2015年6月，我们就AG490对脑缺血损伤的作用及其作用机制进行了相关探讨。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料雄性SD大鼠，体质量250～280 g(北京斯贝福实验动物科技有限公司)，洁净动物房饲喂，大鼠自由饮水进食，饲喂3d，适应环境后进行试验; AG490(美国BioLegend公司); 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(北京化学试剂公司); TNF-α和IL-1β ELISA试剂盒(北京环亚泰克生物医学技术有限公司)。

1.2动物分组与MCAO模型建立依据随机数字表将大鼠分为4组:假手术组、MCAO组、低剂量AG490(3mg/kg)干预组和高剂量AG490(6mg/kg)干预组。大鼠均采用腹腔注射麻醉(10%水合氯醛0.3mL/100 g)，MCAO组采用颈外动脉插栓法，做颈正中切口，暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉，将0.26mm单丝尼龙鱼线头端0.5 cm用石蜡包被，并于20mm处标记，大鼠均通过左侧ECA切口处插入，栓线长度自CCA分叉处18～20mm，根据动物体质量而定，栓塞左侧大脑中动脉，然后缝合皮肤，栓线尾端部分固定于皮肤上。缺血达到2 h后小心抽出栓线，即形成再灌注。假手术组只是不插入尼龙鱼线，其余步骤同MCAO组。低剂量AG490干预组和高剂量AG490干预组分别于术前24 h给予3mg/kg和6mg/kg的AG490腹腔注射，其余步骤同MCAO组。在缺血期间及再灌注后2 h保持体温在(37±0.5)℃。以大鼠手术麻醉清醒后出现右侧肢体瘫痪，站立不稳，提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。

1.3脑缺血损伤程度的评价采用神经行为学评分。参考Ergul等［3］的5分制法，在动物麻醉清醒后6、12、24 h进行评分。0分:无神经损伤症状; 1 分:不能完全伸展对侧前爪; 2分:向对侧转圈; 3分:向对侧倾倒; 4分:不能自发行走，意识丧失。分值越高，说明动物行为障碍越严重。

1.4脑组织梗死范围的检测采用TTC染色法。动物麻醉清醒后24 h将大鼠断头，取出完整的脑组织，迅速置于－20℃的冰箱中，冻存20min。切成5～6片，每隔2mm切一片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处;第二刀在视交叉部位;第三刀在漏斗柄部位;第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间［4］。切片应均匀。将切片置于TTC中，常规浓度为2%，用锡箔纸盖住后，放入37℃恒温箱15～30min，不时翻动脑片，保证均匀接触到染色液。最后，数码相机拍照，计算机计算梗死区域体积所占大脑半球总体积的百分比。

1.5脑组织TNF-α和IL-1β测定动物麻醉清醒后24 h，选取栓塞缺血同侧的大鼠脑组织，匀浆处理脑组织，然后离心，取上清液。采用ELISA法，严格按照ELISA试剂盒说明书操作测定脑组织TNF-α 和IL-1β水平。

1.6统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，神经行为学评分比较采用秩和检验，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组不同时间神经行为学评分比较见表1。

表1　各组不同时间神经行为学评分比较(分，)

表1　各组不同时间神经行为学评分比较(分，)

注:与MCAO组同期比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别　n 24 h神经行为学评分动物麻醉清醒后6 h动物麻醉清醒后12 h动物麻醉清醒后假手术组　10　0＊＊　0＊＊　0＊＊MCAO组　15 1.82±0.58 2.10±0.47 2.68±0.49低剂量AG490干预组　15 1.67±0.73 2.05±0.80 1.82±0.85*高剂量AG490干预组　15 1.65±0.96 1.98±1.02 1.73±0.62*

2.2各组脑组织梗死范围比较假手术组无脑组织梗死发生，MCAO组脑组织梗死范围为(16.84± 4.60)%，低剂量AG490干预组为(10.37± 2.60)%，高剂量AG490干预组为(8.26±3.07)%。MCAO组、高剂量AG490干预组和低剂量AG490干预组脑组织梗死范围均高于假手术组(P均＜0.01);高剂量AG490干预组、低剂量AG490干预组和MCAO组脑组织梗死范围依次增高(P均＜0.01)。

2.3各组脑组织TNF-α和IL-1β水平比较见表2。

表2　各组脑组织TNF-α和IL-1β水平比较(mg/g，)

表2　各组脑组织TNF-α和IL-1β水平比较(mg/g，)

注:与MCAO组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别　n　TNF-α　IL-1β假手术组　10　0.354±0.070＊＊1.647±0.377＊＊MCAO组　10　1.301±0.348　2.703±0.467低剂量AG490干预组　10　0.625±0.220*1.632±0.340＊＊

3　讨论

目前，面对日益加重的老龄化问题，心脑血管疾病已经成为危害人们身体健康的主要疾病，其发病率呈现逐年增高的趋势。脑缺血损伤后的区域主要表现为炎症反应，包括氧自由基产生、水解酶生成、溶酶体破坏、白细胞聚集以及炎症介质形成等方面。脑缺血损伤后的一系列炎症反应，最终会导致血脑屏障受损，内皮细胞的参与会加重脑损害，引起脑水肿。以上的病理生理过程中会有各种各样的炎性因子参与其中，包括TNF-α和IL-1β。

IL-1β是IL-1在脑组织中主要的活性形式，可由内皮细胞和神经胶质细胞等多种活性细胞合成和分泌。其不仅能协同其他细胞因子促进T、B细胞活化，还能诱导其他炎症介质产生，增强内皮细胞与白细胞的黏附，调节TNF-α和IL-6的产生［5，6］。目前认为，IL-1β是一种重要的炎性因子，其失控性表达是炎症反应失控性发生、发展的重要因素，是反映脑缺血急性期损伤程度的标志物［7］。它诱导的炎症反应与JAK/STAT信号通路密切相关［8］。TNF-α具有触发和级联放大炎症反应的作用，是诱导过度炎症反应的关键性促炎因子，在缺血性脑血管病的发病机制中起重要作用，是脑缺血形成后脑组织梗死的主要原因［9，10］。其可诱导细胞黏附因子表达，增加血管内皮细胞通透性，导致炎症介质释放和聚集，在脑缺血损伤后期的炎症细胞浸润和组织损伤中发挥很大作用，因此降低TNF-α的表达是对脑缺血损伤后神经功能障碍的一种保护性措施。本研究结果显示，与假手术组比较，MCAO组、高剂量AG490干预组和低剂量AG490干预组神经功能行为学评分、TNF-α和IL-1β水平高，脑组织梗死范围大;与MCAO组比较，高剂量AG490干预组、低剂量AG490干预组神经功能行为学评分低，TNF-α、IL-1β水平低，脑组织梗死范围小。提示AG490可通过降低TNF-α和IL-1β水平，抑制炎症反应从而起到脑组织保护作用。

研究表明，众多细胞内的信号转导需要借助JAK-STAT信号转导通路，其在缺血性脑血管病中的作用越来越受到关注［11］。本实验采用的干预药物AG490是一种选择性拮抗JAK2酪氨酸磷酸化的抑制剂，能有效地阻断下游信号转导和转录激活子STAT的活化，特异性地抑制JAK-STAT信号转导通路，从而有效地阻断其信号通路的信号转导过程。结果显示采用AG490阻断JAK-STAT信号转导通路后，大鼠脑缺血损伤后的神经功能损伤程度减轻、脑组织梗死范围缩小和炎症反应减轻，因此推断AG490通过抑制JAK-STAT信号转导通路保护脑缺血损伤。

参考文献:

［1］Fenyo IM，Florea IC，Raicum，et al.Tyrphostin AG490 reduces NAPDH oxidase activity and expression in the aorta of hypercholesterolemic apolipoprotein E-deficientmice［J］.Vascul Pharmacol，2011，54(3-6): 100-106.

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［3］Ergul A，ElgebalymM，MiddlemoremL，et al.Increased hemorrhagic transformation and altered infarct size and localization after experimental stroke in a ratmodel type 2diabetes［J］.BMC Neurol，2007，(7): 33.

［4］张均田.现代药理实验方法［M］.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998: 1382，1409-1413.

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［8］Jee SH，Chu CY，Chiu HC，et al.Interleukin-6 induced basic fibroblast growth factor-dependent angiogenesis in basal cell carcinoma cell line via JAK/STAT3 and PI3-kinase/Akt pathways［J］.J Investdermatol，2004，123(6): 1169-1175.

［9］Sairanen T，Carpén O，Karjalainen-LindsbergmL，et al.Evolution of cerebral tumor necrosis factor-alpha productionduring human ischemic stroke［J］.Stroke，2001，32(8): 1750-1758.

［10］Fenyo IM，Florea IC，Raicum，et al.Tyrphostin AG490 reduces NAPDH oxidase activity and expression in the aorta of hypercholesterolemic apolipoprotein E-deficientmice［J］.Vascul Pharmacol，2011，54(3-6): 100-106.

［11］Ke JJ，Wang YL，Li JG，et al.Pretreatment effect of adenosine on activation of NF kappaB and level of TNF-alphaduringmyocardial ischemia and reperfusion in rats［J］.Chin J Traumatol，2004，7(1): 25-27.

·临床研究·

收稿日期:( 2015-07-06)

文章编号:1002-266X(2015)37-0031-03

文献标志码:A

中图分类号:R651.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.010