膦甲酸钠对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及其机制

胡春燕，徐金升，石博，张俊霞，白亚玲，崔立文，张慧然，张胜雷(河北医科大学第四医院，石家庄050011)

膦甲酸钠对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及其机制

胡春燕，徐金升，石博，张俊霞，白亚玲，崔立文，张慧然，张胜雷(河北医科大学第四医院，石家庄050011)

摘要:目的研究膦甲酸钠(PFA)对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响及可能的作用机制。方法体外原代培养大鼠胸主动脉VSMCs，经形态学和免疫细胞化学鉴定后，分别加入10mmol/L的β-甘油磷酸(HP组)和10mmoL/L HP +1mol/L PFA(PFA组)，另设空白对照组。测定各组细胞钙含量，并分别用RTPCR和Western blotting法检测VSMCs核心结合因子α1(Cbfα1)mRNA及蛋白在不同时间点的动态表达情况。结果HP组和PFA组细胞钙含量均高于空白对照组(P均＜0.05)，且PFA组细胞钙含量较HP组明显降低(P＜0.05)。HP组Cbfα1mRNA和蛋白的表达呈“峰-谷-峰”样(P＜0.05)，且第一峰值高于第二峰值(P＜0.05); PFA 组Cbfα1mRNA表现为第二高峰前移，分别于6 h及1d达峰(P均＜0.05)，而蛋白水平达峰时间延后，分别于12 h 和4d达峰(P＜0.05)，且第二峰值均低于第一峰值(P＜0.05)。结论PFA能抑制高磷诱导的大鼠VSMCs钙化，其可能是通过影响高磷诱导的VSMCs表型转化来实现。

关键词:血管平滑肌细胞;膦甲酸钠;β-甘油磷酸;钙化;核心结合因子α1

Effect andmechanism of phosphonoformic acid on β-glycerophosphate-incudced calcification in rat vascular smoothmuscle cells

HU Chun-yan，XU Jin-sheng，SHI Bo，ZHANG Jun-xia，BAI Ya-ling，CUI Li-wen，
ZHANG Hui-ran，ZHANG Sheng-lei
(The Forth Hospital of Hebeimedical University，Shijiazhuang 050011，China)

Abstract:Objective To explore the effect andmechanism of phosphonoformic acid(PFA)on β-glycerophosphateincudced calcification in rat vascular smoothmuscle cells(VSMCs).Methods Primary VSMCs obtained from rat thoracic aorta in vitro were cultured.After being identified withmorphological and immunocytochemistry，VSMCs were added with 10mmol/Lβ-glycerophosphate(HP group)and 10mmol/L HP + 1mmol/L PFA(PFA group)，meanwhile，the control group was set.RT-PCR and Western blot were used todetect the expression ofmRNA and protein of core binding factor α1(Cbfα1)atdifferent time points，respectively.Results Compared with the control group，the cell calcification in the HP group and PFA group was increased(all P＜0.05)，while compared with HP group，the calciumdeposition was significantly reduced in the PFA group(P＜0.05).In the HP group，the expression ofmRNA and protein of Cbfα1 were in a “peak-valley-peak”trend(P＜0.05)，and the first peak was higher than the second one(P＜0.05).In the PFA group，the second peak of Cbfα1mRNAmoved forward，which reached the top at 6h and 1d respectively(all P＜0.05).Unlike the expression ofmRNA，the protein of Cbfα1 reached the top at 12h and 4d，respectively(P＜0.05)，and the second peak was lower than the first one(P＜0.05).Conclusion PFA inhibits β-glycerophosphate-incudced VSMCs calcification possibly by affecting the hyperphosphate-induced phenotypic transdifferentiation of VSMCs.

Key words:vascular smoothmuscle cells; phosphonoformic acid;β-glycerophosphate; core binding factor α1

血管钙化在终末期肾脏病(ESRD)患者中普遍存在，且与正常人相比，ESRD患者血管钙化的程度重，血管壁开始出现钙沉积的年龄更小［1］。有研究表明，血管钙化的存在及其严重程度是ESRD患者心血管

病死率及全因病死率的独立预测因子［2］。血管钙化主要导致血管壁僵硬度增加，脉压增大以及左室肥厚［3］，进而引起血流动力学异常，导致心血管疾病发生，因此研究血管中膜钙化的抑制因素及其机制对于降低ESRD患者的心血管病死率具有重要意义。目前研究表明，高磷血症是血管中膜钙化的独立危险因子，而抑制细胞对磷的摄取可抑制钙化，但其机制尚不明确。2013年3～10月，本实验以高磷诱导的大鼠VSMCs钙化为基础，探讨磷转运体抑制剂膦甲酸钠(PFA)对其钙化的影响及可能机制。

1　材料与方法

1.1材料实验动物:健康雄性SD大鼠6只，5周龄，80～100 g(清洁级)，购自河北医科大学实验动物中心(合格证号: 1303093)。主要实验试剂和仪器:胎牛血清(Hyclone公司)，低糖DMEM培养基(GIBCO公司)，β-甘油磷酸(Scientific research special公司)，PFA(Sigma公司)，总蛋白提取试剂盒(索莱宝公司)，BCA蛋白定量试剂盒(索莱宝公司)，钙含量检测试剂盒(北京中生北控公司)，兔抗鼠平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(北京博奥森生物有限公司)，鼠抗鼠Cbfα1单克隆抗体(Abcam)，兔抗人GADPH多克隆抗体(杭州贤至生物科技有限公司)，荧光标记的抗兔及抗鼠二抗(Cell Signaling公司)，TRIzol(Invitrogen公司)，反转录试剂盒(Thermo公司); CO2培养箱(Thermo公司)，倒置相差显微镜(Nikon公司，型号: TE2000-U)，凝胶成像系统(Image公司)，PCR仪(ABI公司，型号5700型)。

1.2 VSMCs的体外培养SD大鼠麻醉后在超净工作台内迅速取其胸主动脉，剥除血管外膜，纵行剖开血管，无菌纱布擦除破坏内膜，应用组织块贴壁法进行VSMCs原代培养，并进行鉴定。

1.3 VSMCs的鉴定及实验分组形态学观察:应用倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等。免疫细胞化学染色:六孔板内用消毒的盖玻片制作细胞爬片，待细胞生长至60%～70%时，弃去培养基，用PBS洗涤1～2次，95%乙醇固定30min，PBS洗2次，每次2min，加入α平滑肌肌动蛋白抗体(1∶100稀释)，37℃孵育30min后滴加链亲和素生物素复合物，37℃孵育20min，PBS洗4次，每次5min。DAB显色，苏木素复染后，镜下观察。经自然纯化后，选取生长良好的3～5代细胞进行实验。将VSMCs随机分为空白对照组、HP组(培养基含10mmol/L β-甘油磷酸)和PFA组(培养基含10% FBS + 10mmol/L β-甘油磷酸+ 1mmol/L PFA)。24 h更换一次培养液。检测VSMCs钙含量，并于处理后6 h、12 h、1～5d检测Cbfα1的mRNA及蛋白表达情况。

1.4 VSMCs钙含量测定取生长状态良好的3代VSMCs接种于6孔板中，干预5d后，弃去培养液，细胞用0.6mol/L稀盐酸脱钙取上清，应用钙含量检测试剂盒测定细胞钙含量;脱钙后的细胞用0.1mol/L NaOH和0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)溶解30min后取上清，BCA法测定细胞蛋白含量，结果以细胞钙含量比蛋白含量(mg/g蛋白)表示。实验每组设3个复孔。

1.5 VSMCs Cbfα1mRNA测定TRIzol法提取细胞总RNA，应用RT-PCR法检测核心结合因子α1(Cbfα1)的转录情况。应用primer 5.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Cbfα1(289 bp):上游引物5'-CCGCACGACAACCGCACCAT-3'，下游引物5'-CGCTCCGGCCCACAAATCTC-3'; GAPDH(496 bp):上游引物5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，下游引物5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。采用目的基因与内参进行同管扩增，计算相对含量，实验重复3次。

1.6 VSMCs Cbfα1蛋白测定按常规方法提取细胞总蛋白后，应用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，应用Western blotting法测定蛋白表达量，经SDS-聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳分离，转膜、封闭，加一抗(GAPDH 1∶1 000，Cbfα1 1∶500)稀释液，4℃孵育过夜。洗膜，加入荧光二抗稀释液(1∶10 000)，室温下孵育1 h，用免疫荧光成像系统显色，采用Gel-pro4图像分析软件分析条带灰度值，实验重复3次。

1.7统计学方法采用SPSS13.0统计软件。符合正态分布的计量资料用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较用SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 PFA对高磷诱导的VSMCs钙化的影响第5天时，空白对照组、HP组、PFA组钙含量分别为(27.10±3.36)、(83.53±5.77)、(47.18±6.84)mg/g蛋白，与空白对照组相比，HP组和PFA组细胞钙含量均明显增加(P均＜0.05)，PFA组低于HP 组(P＜0.05)。

2.2 PFA对高磷诱导的VSMCs Cbfα1mRNA及其蛋白表达的影响给予高磷刺激后，HP组VSMCs中各时间点Cbfα1mRNA及蛋白表达均高于空白对照组(P均＜0.05)。且随着时间的延长，Cbfα1

mRNA的表达呈现出先上升(6 h第一次达峰，P＜0.05)、后下降(mRNA在12 h达最低，蛋白在1d达最低，P均＜0.05)、之后再次升高(3d再次达峰，P＜0.05)的趋势，呈现“峰-谷-峰”的特点，且第二峰值高于第一峰值(P＜0.05)。PFA组Cbfα1mRNA及蛋白的表达虽仍呈双峰趋势(P均＜0.05)，但与HP组相比，PFA组Cbfα1mRNA表现为第二高峰前移，分别于6 h及1d达峰(P均＜0.05)，且第二峰值低于第一峰值(P均＜0.05);而Cbfα1在蛋白水平的达峰时间有所后延，分别于12 h和4d达峰(P均＜0.05)，且第二峰值仍低于第一峰值(P＜0.05)。见图1、图2，表1、表2。

图1　HP组不同时间点Cbfα图1mRNA(A)及蛋白(B)的表达情况

表1　HP组不同时间点Cbfα1mRNA及蛋白的表达情况()

表1　HP组不同时间点Cbfα1mRNA及蛋白的表达情况()

注:与0 h相比，*P＜0.05;与其他时点相比，#P＜0.05;与6 h相比，△P＜0.05。

时间点　Cbfα1mRNA　Cbfα1蛋白0 h　0.028±0.007　0.276±0.071 6 h　0.672±0.037*　1.143±0.085*12 h　0.368±0.094* #　0.903±0.135*1d　0.566±0.063*　0.350±0.122#2d　0.763±0.048*　1.259±0.212*3d　1.034±0.015* #△　1.644±0.236＊△4d　0.759±0.027*　1.479±0.074*5d　0.485±0.101*　1.083±0.418*F 78.935　17.772 P ＜0.01　　＜0.01

3　讨论

ESRD患者是心血管疾病的高危人群，心血管疾病约占其死亡原因的50%［4］，居于首位。众所周知，动脉钙化是心血管疾病重要的危险因素，也是慢性肾脏病骨和矿物质代谢异常的突出表现。我们前期关于62例ESRD患者桡动脉病理的研究显示，有40.3%的患者存在血管钙化，且均为中膜钙化［5］。而应用尿毒症血清刺激可使VSMCs发生钙化［6］。

高磷血症是血管钙化的独立危险因素，也是其心血管事件及全因死亡率的重要且独立的非传统危险因素，而控制高磷血症则可以降低ESRD患者病死率［7］。高磷血症在ESRD患者中十分普遍，一项对维持性血液透析患者的大型、多国联合调查显示，50%左右的患者存在高磷血症［8］。磷从细胞外转运至细胞内主要是由钠依赖的磷共转运体介导的，有研究显示，在VSMCs上有Ⅲ型钠依赖的磷共转运体Pit-1和Pit-2存在，而Ⅰ型和Ⅱ型没有检测到，且Pit-1含量较高，Pit-2含量较少［9，10］，敲除Pit-1后能

显著减少人VSMC的钙化［11］。PFA是钠磷共转运体的竞争性抑制剂，能以剂量依赖的方式抑制细胞的磷摄取［10］。所以本实验选用PFA干预VSMCs，观察其对高磷诱导的VSMCs钙化的影响。本研究结果显示，与空白对照组相比，高磷能诱导血管钙化，而抑制磷摄取后可以减轻血管钙化的程度，但不能完全消除高磷对VSMCs的影响。

图2　PFA组不同时间点Cbfα图1mRNA(A)及蛋白(B)的表达情况

表2　PFA组不同时间点Cbfα1mRNA及蛋白的表达比较()

表2　PFA组不同时间点Cbfα1mRNA及蛋白的表达比较()

注:与0 h相比，*P＜0.05;与其他时点相比，#P＜0.05;与1d相比，△P＜0.05;与12 h相比，▲P＜0.05。

时间点　CbfαlmRNA　Cbfαl蛋白0 h　0.048±0.002　0.233±0.039 6 h　0.947±0.113* #△　0.618±0.111*12 h　0.262±0.032*　1.260±0.231* #1d　0.624±0.111* #　0.910±0.263*2d　0.348±0.054*　0.460±0.062 3d　0.333±0.045*　0.565±0.132 4d　0.398±0.017*　0.951±0.107＊▲5d　0.263±0.056*　0.476±0.054 F 52.050　15.371 P ＜0.01　　＜0.01

目前的研究认为，VSMCs发生成骨/成软骨样表型转化在血管钙化中起关键作用，而Cbfα1是其中起关键作用的转录因子。已有实验表明Cbfα1的表达上调与血管钙化程度具有相关性［12，13］。我们前期的实验结果显示，高磷可诱导Cbfα1呈“峰-谷-峰”样的动态改变［14］。为了进一步明确PFA抑制VSMCs钙化的可能机制，我们对各组VSMCs Cbfα1的动态表达情况进行了检测。本研究结果显示，给予高磷刺激后，Cbfα1mRNA的表达情况与我们之前的研究结果相似，Western blotting法检测其蛋白表达也呈类似的“双峰样”变化趋势。而在PFA组不论是在转录还是翻译水平，Cbfα1的表达仍呈“双峰”，但在mRNA水平上第二高峰明显前移;在蛋白水平的达峰时间有所后延，且第二峰值仍低于第一峰值。提示PFA通过抑制磷摄取后能影响Cbfα1的表达情况，进而对抑制VSMCs的表型转化起了一定作用，至少抑制其进一步的转分化。但PFA组中仍有Cbfα1的表达，可能与所应用的浓度及刺激时间有关。

综上所述，PFA能抑制高磷诱导的VSMCs钙化，其机制可能是通过影响高磷诱导的VSMCs表型转化来实现的。但具体的信号通路还需进一步深入探讨，从而为慢性肾脏病患者血管钙化的防治提供理论基础。

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·基础研究·

收稿日期:( 2015-06-07)

通信作者简介:徐金升(1964-)，男，主任医师，主要从事慢性肾脏病及血液净化相关并发症及机制方面研究。E-mail: xls5766@126.com

作者简介:第一胡春燕(1976-)，女，主治医师，主要从事慢性肾脏病血管钙化发病机制方面研究。E-mail: huchunyan0309@126.com

基金项目:河北省自然科学基金资助项目(H2012206157)。

文章编号:1002-266X(2015)37-0022-04

文献标志码:A

中图分类号:R692.5

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.007