大鼠弥漫性轴索损伤后高迁移率族蛋白1的动态表达及其对神经细胞凋亡的影响

庞宏刚，宋锦宁，李丹东，孙 鹏，赵永林，黄廷钦，翟海程，安吉洋

（西安交通大学医学部第一附属医院神经外科，陕西西安 710061）

弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）是脑外伤患者重要的死亡原因，但是其具体机制仍不清楚。近来研究证实，在DAI后轴索损伤部位存在明显的小胶质细胞活化，IL-1、IL-6和TNF-a等炎症因子表达显著升高［1-2］，证明炎症反应在DAI后脑损伤中起着重要作用。探索DAI后炎症诱导机制是目前DAI研究亟需解决的关键问题。高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB-1）是病理情况下诱导多种炎症因子表达的上游激活分子。在动物研究中已证实脑缺血或蛛网膜下腔出血后脑组织中HMGB-1的水平明显升高，并且抑制HMGB-1可以显著减轻缺血后炎症反应，改善预后［3-5］。脑外伤的临床研究中也发现，患者外周血清中HMGB-1的水平明显升高，并且与预后明显相关［6］。上述研究结论均证实，作为重要的炎性分子，HMGB-1可能是DAI后导致脑组织炎性损伤的重要潜在机制。但是，DAI后脑组织中HMGB-1的表达水平及分布的动态变化目前还不清楚，也未见国内外相关研究报道。因此，本研究采用瞬时机械旋转制作大鼠DAI模型，通过免疫组化、Western blot、RT-PCR等方法全面测定DAI后脑组织中HMGB-1的表达，并采用TUNEL观察DAI后细胞凋亡水平，探讨HMGB-1在DAI后脑组织损伤中的作用机制，为临床治疗DAI提供靶点。

1 材料与方法

1．1 实验动物和试剂 雄性健康成年Sprague-Dawley大鼠84只，体质量280～300g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供（许可证号：SCXK（陕）2007-001）。采用随机数表法将实验大鼠随即分为正常组（12只）和DAI组6h、1、3、7d组各18只，共84只。兔抗HMGB-1抗体（美国Epitomics公司）和小鼠抗β-actin（美国Santa Cruz公司），TUNEL凋亡试剂盒（美国Promega公司），过氧化物酶标记的链霉卵白素（SP）染色试剂盒及二氨基联苯胺显色试剂盒（北京中杉金桥生物公司），光镜（CX21，日本Olympus公司），图像采集及分析系统（Leica-Q550CW，德国）。

1．2 大鼠头颅瞬间旋转损伤模型 大鼠DAI模型的制作采用刘晓斌等［7］的方法：DAI组大鼠首先使用100g／L水合氯醛（3mL／kg）腹腔注射麻醉，然后将其置于高约20cm的硬质平台上，将大鼠门齿固定于门齿孔，其次将耳棒插入双侧耳道并适度旋紧，将大鼠头部水平固定于造模仪横向杆上，躯干与平台呈25～30°。限位孔设置于90°（即造模时旋转90°），拔除卡位条，限位盘迅速旋转复位并与限位销发生剧烈撞击产生瞬时停止，以此来模仿DAI发病过程中的剪切力作用。上述固定-卡位-打击-复位为1个致伤周期，重复8次。

1．3 常规组织病理学检测与免疫组化检测 正常组及DAI组大鼠分别于术后6h、1、3、7d经生理盐水左心室灌注取脑，40g／L多聚甲醛固定24h，石蜡包埋并自后向前连续冠状切片，片厚5μm，裱于载玻片，用于HE、Glees-Marsland镀银染色、Mallory磷钨酸苏木素染色及免疫组化染色。免疫组化染色采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶链接法。首先将切片脱蜡水化，30mL／L过氧化氢去离子水室温孵育30min，通过微波加热抗原修复，血清封闭后，加抗HMGB-1单克隆抗体（1∶200），4℃恒温过夜。生物素化二抗37℃孵育30min，HRP标记链霉卵白素37℃孵育30min。DAB显色，苏木素复染，脱水并中性树胶封片。光镜下观察皮层脑组织HMGB-1的表达及分布，Leica-Q550CW图像分析系统采集图像。

1．4 RT-PCR检测HMGB-1mRNA的表达 各组大鼠于预定时间点灌注取脑，分离皮层组织。采用RNAiso Plus提取总 RNA，提取总 RNA 500ng，合成cDNA，应用Premix Taq酶以cDNA为模板加入HMGB-1及GAPDH引物（HMGB-1及GAPDH引物序列：HMGB-1上游ATGGGCAAAGGAGATCCTA，下游 ATTCATCATCATCATCATCTTCT；GAPDH 上游 TGGTGGACCTCATGGCCTAC，下游CAGCAACTGAGGGCCTCTCT），通过如下反应条件：94℃5min，94℃50s，56℃ 60s，72℃60s，共30个循环，72℃延伸7min。琼脂糖凝胶电泳确定反应产物，溴化乙锭显色，运用Gel Pro 3．1分析软件计算HMGB-1与内参GAPDH的吸光度比值，以此表示各组HMGB-1的mRNA水平。

1．5 Western blotting检测HMGB-1的表达 各组大鼠于造模后相应时间点灌注取脑，提取皮层脑组织蛋白，BCA法蛋白定量。取50μg蛋白样品，SDSPAGE电泳，半干法转膜，随后将膜置于50g／L脱脂牛奶中37℃封闭2h，一抗（HMGB-1，1∶3 000；β-actin，1∶1 000）4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜3次，将膜与HRP标记的二抗（1∶5 000）室温孵育1h，TBST洗膜3次后，化学发光法显影，并采用Quantity One软件测定条带吸光度并行统计学分析。

1．6 TUNEL检测皮层神经元凋亡 各组大鼠在造模后相应时间点灌注取脑，40g／L多聚甲醛溶液中固定24h，石蜡包埋后连续冠状切片，片厚5μm。按照TUNEL凋亡试剂盒提供步骤进行TUNEL染色。图像分析系统采集图像，每张切片随机选取5个高倍视野（×400），计数TUNEL阳性细胞数。

1．7 统计学分析 应用SPSS 16．0统计软件对资料进行分析。数据采用均数±标准差（±s）的形式表示，各时间点上实验组与对照组的比较，在满足正态性和方差齐性的条件下，采用独立样本t检验；若不满足条件，则采用秩和检验，P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 DAI后脑组织的病理学改变 HE染色显示，正常脑组织皮层神经细胞形态完整，呈球形或锥形，核大而圆，核异染质少，着色浅（图1A）；DAI后皮层脑组织间质明显水肿，神经元呈明显收缩变形，胞核固缩，胞质深染，呈明显嗜酸性（图1B）。Glees-Marsland镀银染色可见，正常神经轴突走形平滑，未见明显迂曲及轴索球（图1C）；DAI后出现明显的神经轴索断裂及轴索球形成（图1D）。Mallory磷钨酸苏木素染色可见，正常轴突走形均匀平滑（图1E）；DAI后出现明显轴突肿胀，走形迂曲，并伴有断裂（图1F）。

图1 大鼠DAI后脑组织的病理学改变Fig．1 Microscopic observation of the cross-sections of the brain of rats subjected to DAI（×400）

2．2 DAI后大鼠脑组织中HMGB-1的表达及分布

2．2．1 免疫组化染色观察 HMGB-1阳性染色呈棕黄色，在正常大鼠脑皮层组织中HMGB-1有少量表达，主要分布于细胞核，胞质及间质均未见阳性表达（图2A）。DAI后6h及1d组，HMGB-1阳性细胞减少（图2B、2C），DAI后3d及7d组，HMGB-1阳性细胞逐渐增多（图2D、2E）。

图2 HMGB-1在DAI大鼠脑组织中的表达Fig．2 Immunohistochemical observation of HMGB-1on the cross-sections of the cortex following DAI（×200）

2．2．2 Western blot定量分析结果 DAI后大鼠皮层HMGB-1水平在6h、1d时间点呈显著降低，在DAI后3d时间点HMGB-1水平达到峰值，并持续至DAI后7d，统计学分析显示DAI各亚组与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05，图3）。

图3 DAI后大鼠皮层HMGB-1水平的时相性改变Fig．3 The dynamic expression of HMGB-1in the cortex of rats subjected to DAI

2．2．3 DAI后脑组织HMGB-1mRNA表达的动态改变 DAI后HMGB-1mRNA表达于造模后6h开始较对照组升高，但差异无统计学意义（P＞0．05）；DAI后1d开始HMGB-1mRNA水平较对照组明显升高，并于DAI后3、7d呈显著的持续升高。统计学分析显示，DAI后1、3、7d脑组织HMGB-1mRNA水平与对照组之间差异有统计学意义（P＜0．05，图4）。

2．3 DAI对脑组织细胞凋亡的影响 正常情况下，脑组织中仅有很少TUNEL阳性细胞（图5A）。DAI后6h，TUNEL阳性细胞明显增加（图5B），并持续增加，至3d时达到最多（图5D），一直持续至DAI后7d（图5E）。统计学分析DAI后各时间点凋亡细胞数与正常对照组之间差异有统计学意义（P＜0．05）（图6），并且进一步相关性分析显示细胞凋亡数量与HMGB-1的表达水平并无明显相关性。

图4 DAI后HMGB-1mRNA的时相性表达Fig．4 The time course of HMGB-1mRNA expression in the cortex after DAI

3 讨 论

本研究采用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置制作大鼠DAI模型，该模型制作方法的稳定性已被大量研究证实［8］。在实验中我们采用了HE、Glees-Marsland镀银染色、Mallory磷钨酸苏木素染色3种组织病理学染色对该模型进行了评价，结果显示造模后脑组织出现典型的轴索损伤断裂及轴索球的形成，均证实模型的可靠性与稳定性。

图5 TUNEL染色观察DAI后脑组织中的细胞凋亡情况Fig．5 TUNEL staining of the cortex in DAI groups（×400）

图6 DAI模型组与对照组TUNEL阳性细胞计数的比较Fig．6 Cell count of TUNEL-positive cells in DAI and control groups

HMGB-1是一种DNA结合蛋白，在脑组织中HMGB-1主要存在于神经元及胶质细胞胞核。既往研究发现，脑缺血后HMGB-1可被坏死的神经元或激活的胶质细胞释放至细胞外间隙，与细胞表面炎性受体 RAGE（receptor for advanced glycation end products）及 TLR2／4（Toll-like receptor2／4）受体结合［9-10］，激活下游炎性反应信号通路［11］，从而诱导多种炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β等）的表达［12-13］。本实验免疫组化观察结果显示，HMGB-1在正常脑组织中主要存在于细胞核，细胞质及组织间质中几乎无表达；DAI后6h，皮层脑组织中的HMGB-1阳性细胞明显减少，可能为HMGB-1细胞外间隙释放所致，但是随后呈现了逐渐增加的趋势，直到造模后7d，仍然处于较高水平。而采用Western blot对DAI后皮层脑组织中HMGB-1水平进行定量分析发现，DAI后6h及1d，皮层脑组织中HMGB-1水平呈显著降低，直到3d时间点才开始显著升高，一直持续到DAI后7d。分析其原因，首先可能是由于DAI后细胞坏死释放HMGB-1至细胞外发挥作用，导致脑组织中原有的HMGB-1水平降低，而HMGB-1的表达此时并未升高，因此呈现HMGB-1阳性细胞的减少；其次可能是HMGB-1在早期就转录激活并表达升高，而升高的HMGB-1可能与相应的受体结合发挥其作用，从而导致无法测定。本实验同时采用RTPCR对HMGB-1mRNA表达进行检测，发现DAI后早期（6h）HMGB-1mRNA表达较对照组无明显增加，1d时间点增加幅度虽较对照有显著差异，但是仍处于较低水平，直到DAI后3d，HMGB-1mRNA的表达才开始大幅度显著升高，一直持续至DAI后7d。实验结果证实了DAI后HMGB-1水平的这种先降低，后期才开始逐渐升高的动态变化与其mRNA转录激活较晚有关。这也恰好解释了DAI后早期HMGB-1水平仅轻度升高，而到了3d后开始大幅度升高。

近来的研究已经证实多种炎症因子在DAI后表达增加［2］。但是既往研究证实TNF-α等属于早期炎症因子［14］，抑制 TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子并不能显著改善脑外伤患者的预后。在本实验中，DAI后早期释放至细胞外间隙的仅是细胞核原有的少量HMGB-1，其mRNA及蛋白水平的表达在DAI后3d才开始大幅度显著升高。这也与既往研究结果一致。HMGB-1属于一种晚期阶段的促炎因子，它早期阶段主要由坏死的细胞释放，而在晚期则主要由激活的炎性细胞表达释放［14］。既往研究证实，在脑缺血后HMGB-1主要来自于坏死的神经元或活化的小胶质细胞［3］，而在外周炎症反应中其主要来自于活化的单核巨噬细胞［15］。DAI后，脑组织中也会有大量外周炎性细胞浸润，浸润的炎性细胞是否会大量释放HMGB-1，从而诱发脑组织的炎症反应，目前还不清楚。但是，近来研究人员发现，在蛛网膜下腔出血中，HMGB-1主要来自于活化的小胶质细胞，而并非浸润到脑组织中的巨噬细胞［4］。

在本实验中，DAI后6h神经元凋亡已明显增加，并呈持续增加趋势，DAI后3d达到高峰，一直持续至DAI后7d仍处于较高水平，分析其原因，这是因为HMGB-1主要来自于坏死或活化的细胞，凋亡细胞并不释放HMGB-1至细胞外间隙［16］。因此，凋亡细胞数量的增加并不能导致HMGB-1水平的升高，并且HMGB-1发挥促炎作用不仅与其表达水平相关，还与其向细胞外的释放相关。还有，本研究中将脑组织中HMGB-1水平与神经细胞凋亡做相关性研究并不能完全解释HMGB-1与细胞凋亡之间的本质关系。既往在肝脏疾病的研究中发现，HMGB-1明显参与了肝细胞的凋亡过程［17］。但是也有部分研究证实外源性给予HMGB-1不仅能抑制细胞凋亡，还能促进细胞的增殖［18］。因此，DAI后HMGB-1介导的炎症反应是否可导致DAI后神经细胞凋亡及其潜在机制仍需要进一步的研究。

总之，HMGB-1在脑外伤后作用及其机制的研究仍处于起始阶段，DAI后脑组织内HMGB-1表达呈逐渐升高的动态变化，通过干预HMGB-1是否可以改善DAI患者的预后仍需要更多的研究来证实。

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