2型糖尿病致阿尔茨海默病损伤大鼠模型的建立及鉴定

刘 涛，王文婷，宋海峰，杨 利，郭 俊，张衍国

（第四军医大学唐都医院：1．皮肤科；2．内分泌科；3．神经内科，陕西西安 710038）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是老年痴呆的最常见原因，它是一种原因不明的、进行性的、中枢神经系统的退行性疾病，其特征性病理改变为大脑皮层及脑区的细胞外间隙的β淀粉样蛋白（βamyloid peptide，β-AP）和细胞内多聚Tau蛋白的沉积［1］。2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）患者认知功能异常或AD的发病率较正常对照人群高2～3倍。有学者提出将 AD称作“3型 DM”［2］。但T2DM致AD的发病机制至今尚未明确，建立T2DM致AD的动物模型有利于研究其具体的发病机制。目前为止，已报道的建模方法与临床上T2DM致AD自然病程存在较大出入，且建模方法及模型评价上尚未统一。本研究采用高脂高糖饮食持续喂养老年大鼠模拟临床T2DM致AD自然病程以建立动物模型并鉴定，以期为更好地阐明T2DM致AD的具体机制提供相对客观真实的大鼠模型。

1 材料与方法

1．1 实验动物 100只体质量500～600g正常雄性SD老龄大鼠（18月龄以上），由第四军医大学实验动物中心提供，动物许可证号：scxk（军）2007-007。

1．2 试剂及设备 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）粉剂（Sigma公司）溶于0．1mol／L pH4．3的柠檬酸钠缓冲液中，配制成20mg／mL的溶液；血糖仪（强生稳豪）；DMS-2型Morris水迷宫（第四军医大学唐都医院中心实验室）；脑立体定位仪（日本Narishige公司）；微透析设备：灌注器推进泵（Baby Bee Syringe Drive，MD 1001），灌注器（1mL Bee Stinger Gastight Syringe，MD 0100），灌注器支架（32Syringe Bracket for Baby Bee，MD1002），流速控制器（Work Bee Controller，MD1000）均为美国BAS公司产品；ELISA检测试剂盒（德国DRG公司；比利时Innogenetics公司）；金属电极（TM53A05型电极，美国WPI公司）。

1．3 方法

1．3．1 T2DM致AD损伤大鼠模型的建立及实验分组 老年SD大鼠100只，以高脂高糖饮食（其比例为化猪油23%、蔗糖21%、蛋黄粉9%、基础饲料47%）喂养，连续喂养6周。然后按30mg／kg体质量剂量尾静脉注射STZ后，48～72h后清晨取空腹尾静脉血测空腹血糖和空腹胰岛素水平（强生稳豪血糖仪测血糖，德国DRG公司ELISA试剂盒测空腹胰岛素水平），每天检测1次，连测3d并统计分析。空腹血糖平均值≥16．7mmol／L即确定为T2DM 大鼠。将T2DM大鼠继续饲养4周，采用Morris水迷宫试验对大鼠进行测试，统计分析后筛选出对学习、记忆、新联想形成和执行功能异常大鼠；进一步运用脑脊液微透析技术（microdialysis，MD）和ELISA试剂盒（比利时Innogenetics公司）检测海马区脑脊液中β-AP含量确认AD的发生。将发生AD损伤大鼠入T2DM＋AD组，另设普通饮食组（10只老年SD大鼠，普通饲料喂养）和单纯T2DM组进行对照分析；T2DM＋AD组大鼠行为学实验结束后行大鼠海马CA1区银浸染色确证AD发生。

1．3．2 银浸染色（Bodian，Bielschowsky） 所有T2DM＋AD组大鼠脑标本参照MIRRA等［3］的染色方法，选取含海马CA1区脑组织，经40g／L甲醛溶液固定，常规脱水、浸蜡，石蜡包埋，切5μm厚的连续切片，做银浸染色。

1．3．3 Morris水迷宫试验 建立T2DM大鼠模型，应用 Morris水迷宫（Morris Water Maze，MWM）进行行为学检测，测试其空间学习和记忆能力。Morris水迷宫为直径90cm、高40cm的圆形水池，水深30cm，在水池壁上标明4个入水点，由此将其等分为4个象限，于第3象限中心置一有机玻璃圆形平台，平台低于水面2cm，水温（24±2）℃。测试内容包括：①定位航行实验（place navigation）。历时5d，每天训练2次。将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入池中，测其90s内成功寻找到平台所需时间，即逃避潜伏期（escape latency）。若大鼠入水后90s内未能找到平台，则将其置于平台上并停留10s。②空间探索试验（spacial probe test）。定位航行试验结束后撤除平台，任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录90s内跨越原平台位置的次数，以及平台象限内大鼠游泳路径的百分比。数据的采集和处理均通过Morris水迷宫自动监视处理系统完成。

1．3．4 脑脊液微透析技术（microdialysis，MD）和ELISA检测 大鼠麻醉后，固定于脑立体定位仪，头部正中切开，暴露双侧颞骨，根据Paxinos Watson大鼠脑图谱，在前囟后3．3mm，正中矢状缝旁开2mm，硬脑膜下3．5mm，将探针的导轨定位于大鼠海马区，并在导轨周围颅骨上呈三角形固定3枚小螺钉，而后用牙科水泥固定，保证导轨不随大鼠正常活动而移动或松动。术后将大鼠单独饲养，保证清洁充足的饮水及食物，恢复1d，备用。完成导轨埋置手术大鼠，MD检测前在麻醉状态下取下导轨套管塞，将已平衡好的MD探针沿导轨插入大鼠海马内，以人工脑脊液做灌流液，开启MD灌流系统，调节微量注射泵控制灌流液流速恒定为2．5L／min。在脑内稳定平衡60min后，分别在20、40、60、80、100、120min时收集 MD液各50μL，共收集6管。收集好的MD液即刻转入-20℃冰箱保存。透析结束后，颈椎脱臼处死大鼠，断头取脑解剖，找到海马区，观察验证透析探针位置是否正确。收集好的MD液用ELISA检测试剂盒检测。

1．3．5 电生理记录 在屏蔽实验台内利用“在体单细胞电生理记录单元”（S24045-SET购自澳大利亚Powerlab公司）进行电生理记录。大鼠麻醉后，固定于脑立体定位仪，头部正中切开，暴露双侧颞骨，根据Paxinos Watson大鼠脑图谱，在前囟后3．3mm，正中矢状缝旁开2mm，硬脑膜下3．5mm，依次切开头皮各层并切开硬脑膜，微推进器以步进方式调节电极位置（10μm／步），将金属电极缓慢推送至大鼠海马区，用示波器观察记录放电，同时信号经过A／O转换后储存于计算机中。当放电幅值较高时，停止推进电极，并等待约10min，待信号稳定后脑脊液中灌流乙酰胆碱（Ach）开始记录海马区神经元细胞放电序列和频率。

1．4 统计学方法 采用SPSS 13．0统计软件处理。实验数据用（±s）表示，对满足方差齐性的资料采用方差分析及SNK-q检验进行两两比较；否则，采用非参数Kruskal-Wallis H 检验进行组间比较。P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 成功建立了T2DM老年大鼠模型 100只老年SD大鼠持续高脂高糖饮食喂养并STZ处理后，空腹血糖检测表明，其中有97只SD大鼠为T2DM大鼠，T2DM建模成功率为97%。与普通饮食组比较，T2DM组大鼠血糖水平、血浆胰岛素水平显著高于普通饮食组（P均＜0．01）。根据HOMA公式计算出的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）显示，T2DM组的HOMA-IR指数显著高于普通饮食组（P＜0．01），表明T2DM大鼠造模成功（表1）。

表1 两组实验大鼠实验室检查指标的比较Tab．1 Comparison of laboratory examination results of the experiment animals in the two groups（±s）

表1 两组实验大鼠实验室检查指标的比较Tab．1 Comparison of laboratory examination results of the experiment animals in the two groups（±s）

与 T2DM 组比较，＊P＜0．01；HOMA-IR＝空腹血糖水平（FPG，mmol／L）×空腹胰岛素水平（FINS，IU／L）／22．5。

组 别 数量（只） 血糖（mmol／L） 体质量（g） 血浆胰岛素水平（IU／L）HOMA-IR T2DM 组 97 27．35±4．55 560．2±12．5 25．22±2．14 28．08±4．13普通饮食组 10 5．24±2．61＊ 420．1±10．2 11．55±3．11＊ 2．13±1．08＊

2．2 动物行为学及β-AP检测 100只老年SD大鼠持续高脂高糖饮食喂养后，在已确认建模成功的97只T2DM老年大鼠中，有13只老鼠表现出认知功能障碍，即T2DM＋AD大鼠组。Morris水迷宫检测表明，这部分老年T2DM大鼠出现AD症状（表2），海马区域脑脊液微透析并β-AP水平检测证实AD发生，海马CA1区病理染色确证AD发生（图1）。

2．2．1 大鼠Morris水迷宫实验结果 大鼠确认造模成功后，分别在第2周和第4周用Morris水迷宫测试其定位航行能力。从表2、表3显示的结果可见，普通饮食组和T2DM组大鼠随训练次数的增加，逃避潜伏期越来越短，2组间无统计学差异；T2DM＋AD组大鼠的逃避潜伏期在第2周和第4周均明显延长于普通饮食组和T2DM组，差异有统计学意义（P＜0．01）；特别在后潜伏期（3～5d），T2DM＋AD组的逃避潜伏期明显比普通饮食组和T2DM组延长，差异有统计学意义（P＜0．01）。穿越实验结果表明，T2DM＋AD组大鼠在90s内的穿越平台次数的均值较普通饮食组和T2DM组都有所减少，特别是与T2DM组比较显著减少（P＜0．05，表4）。Morris水迷宫实验结果表明，T2DM＋AD组大鼠存在明显的学习、记忆功能障碍，而普通饮食组和T2DM组大鼠无明显差异。

表2 各组大鼠建模后第2周逃避潜伏期的测试结果Tab．2 Escape latency test results from different established rat models after two weeks（±s）

表2 各组大鼠建模后第2周逃避潜伏期的测试结果Tab．2 Escape latency test results from different established rat models after two weeks（±s）

普通饮食组与T2DM组比较无明显差异；普通饮食组与T2DM＋AD组比，＆P＜0．01；T2DM组与T2DM＋AD组比，＊P＜0．01；D：天数；s：秒。

组 别 数量（只） D1（s） D2（s） D3（s） D4（s） D5（s）普通饮食组 10 35．62±6．34 14．38±6．23 10．98±4．11＆ 8．86±3．24＆ 8．82±4．38＆T2DM 组 84 36．67±5．89 16．65±5．68 11．12±3．54＊ 9．95±2．69＊ 9．24±4．15＊T2DM＋AD组 13 38．14±4．67 19．58±6．18 31．55±6．08 30．27±5．67 32．33±6．24

表3 各组大鼠建模后第4周逃避潜伏期的测试结果Tab．3 Escape latency test results from different established rat models after four weeks（±s）

表3 各组大鼠建模后第4周逃避潜伏期的测试结果Tab．3 Escape latency test results from different established rat models after four weeks（±s）

普通饮食组与T2DM组比较无明显差异；正常组与T2DM＋AD组比，＆P＜0．01；T2DM组与T2DM＋AD组比，＊P＜0．01。D：天数；s：秒。

组 别 数量（只） D1（s） D2（s） D3（s） D4（s） D5（s）普通饮食组 10 13．33±3．23＆ 11．53±3．67 13．69±3．21＆ 7．58±3．33＆ 8．82±1．68＆T2DM 组 84 15．17±1．28＊ 10．98±5．66 11．41±4．65＊ 8．91±2．49＊ 7．21±3．25＊T2DM＋AD组 13 31．55±14．47 19．95±9．98 28．31±8．18 25．32±15．16 16．43±6．82

2．2．2 大鼠海马区β-AP的检测结果 3组大鼠海马区β-AP检测结果显示，普通饮食组、T2DM组、T2DM＋AD组大鼠海马区域脑脊液中β-AP平均浓度分别为（12．31±1．54）pg／mL、（14．67±1．62）pg／mL和（24．87±3．54）pg／mL，与 T2DM 组及普通饮食组比较，T2DM＋AD组大鼠海马区域脑脊液中β-AP水平显著升高（P＜0．01）。

2．2．3 大鼠海马CA1区病理检查结果 T2DM＋AD组大鼠海马CA1区银浸染色表明，有老年斑和神经原纤维缠结丝存在，确认T2DM＋AD组大鼠AD发生（图1）。

2．3 电生理记录 T2DM组和T2DM＋AD组各随机挑选10只大鼠行海马神经元灌流Ach并记录所引发的动作电位频率，结果表明，T2DM组大鼠海马神经元放电频率平均为（22±2）Hz，而T2DM＋AD组大鼠海马神经元放电频率平均为（11±1）Hz。T2DM组放电频率显著高于T2DM＋AD组（P＜0．01，图2）。

表4 各组大鼠建模后穿越实验的测试结果Tab．4 Cross experiment results from different established rat models（±s）

表4 各组大鼠建模后穿越实验的测试结果Tab．4 Cross experiment results from different established rat models（±s）

普通饮食组与T2DM组比较无明显差异；T2DM组与T2DM＋AD组比，＊P＜0．05，N：次数。

组 别 数量（只） 第2周（N） 第4周（N）普通饮食组10 3．88±2．11 3．99±1．67 T2DM组 84 4．59±2．21＊ 4．45±1．65＊T2DM＋AD组13 2．72±1．34 2．81±2．02

图1 海马CA1区老年斑和神经原纤维缠结丝的病理Fig．1 The pathologic results of senile plaque （SPs）and neurofibrillary tangles（NFTs）in hippocampus CA1areas of the rats

图2 两组大鼠海马神经元平均放电频率Fig．2 Average discharge frequency of two groups of rats in hippocampus neurons（n＝10）

3 讨 论

临床观察表明，60岁以上的糖尿病患者中AD患病率约为10%左右［4］。近30年来，我国糖尿病患病率尤其是T2DM患病率显著增加。最近10年糖尿病流行情况更为严重，相应地，我国AD的患病率也在逐年上升［5］。迄今，尽管已提出多种关于AD的发病机制假说，但与T2DM相关的AD潜在发病机制仍未完全阐明，这与缺乏相应合适的动物模型有密切关系。长期以来，国内外不少专家都致力于寻找与临床病程相似的T2DM致AD动物模型以探究其发病机制，已有的动物模型均为采用在T2DM老年大鼠海马区域注射Aβ人为促使AD的发生［6］，这样建立的动物模型不能较好地模拟T2DM致AD自然过程，认可度并不高。本研究采用高脂高糖饮食持续喂养老年大鼠模拟临床T2DM致AD自然病程以建立T2DM致AD动物模型。Morris水迷宫实验检测表明，T2DM致AD模型大鼠在确诊T2DM基础上表现出明显的学习、记忆功能障碍，并且海马区域脑脊液中β-AP水平明显升高，海马神经元灌流Ach后记录的动作电位频率也显著下降；病理检查结果表明，中枢神经系统中有老年斑和神经原纤维缠结丝发生。这些检测指标均确认建模成功。另一方面，采用本方法建模其成功率为13%，这与临床报道中T2DM患者AD发病率较接近［7］，这也间接证明本建模方法能较好地模拟T2DM致AD的临床过程，采用本方法建模的科学性较强。但本建模方法也有其不足，一是建模周期长，二是建模成本较高，需要我们在今后的科研工作不断完善。

已有研究表明，T2DM致神经系统损伤的机制主要包括［8］：高血糖的毒性作用、脑血管的病理改变（脑血管改变、脑血流改变）、神经营养因子的变化（NGF、BDNF、IGF-1）、神经调质的改变（Glu受体改变、胰岛素及其受体改变、神经递质改变）等。尽管目前对T2DM认知功能障碍详尽的神经机制尚不完全清楚，但有研究表明T2DM条件下，中枢神经系统中高血糖的直接毒性、胰岛素抵抗及胰岛素细胞信号转导异常、高胆固醇血症毒性、载脂蛋白E表达增多、胰岛素样生长因子表达异常、IDE基因异常和炎性作用等均可致上述神经系统损伤发生［9］，最终导致大脑皮层及脑区的细胞外间隙的β淀粉样蛋白和神经细胞内多聚Tau蛋白的沉积［10］，促使AD发生。虽然目前T2DM致AD的发病机制仍未完全阐明，但建立了科学、可靠的动物模型，有助于观察T2DM和AD的密切联系并探讨T2DM致AD的发病机制，进而为AD防治药物开发提供帮助。

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