茶与葡萄皮总多酚的提取、纯化及抗氧化活性

易运红,张敏娟,吕君亮,张丹虹,吴功庆，*

(1.广东药学院 医药化工学院,广东中山 528458；2.郑州工业贸易学校基础部,河南郑州 450007)



茶与葡萄皮总多酚的提取、纯化及抗氧化活性

易运红1,张敏娟2,吕君亮1,张丹虹1,吴功庆1，*

(1.广东药学院 医药化工学院,广东中山 528458；2.郑州工业贸易学校基础部,河南郑州 450007)

本研究以乌龙茶与葡萄皮为研究对象,在单因素实验基础上,采用 Box-Behnken实验设计以及响应面分析对乙醇浸提乌龙茶与葡萄皮总多酚的工艺进行优化,再以NKA9型大孔树脂纯化,测定纯化多酚的还原力以及羟自由基清除率,评价其抗氧化活性强弱。结果表明:总多酚提取最佳工艺条件为温度88℃,乙醇浓度48%,液料比22∶1(mL/g),时间40min,总多酚的得率可达4.76%,理论预测为4.79%,相差0.62%,响应面优化的回归方程有一定实践指导意义。NKA9型大孔树脂纯化精制后多酚含量由25.54%提高至82.19%。以抗坏血酸作对照,测定精制多酚的还原能力和羟自由基消除能力,精制乌龙茶与葡萄皮总多酚的还原力和羟自由基消除能力均优于同浓度的抗坏血酸,总多酚对·OH的消除率达50%时的浓度IC50为17.60μg/mL,抗氧化活性较好。

乌龙茶,葡萄皮,总多酚,响应面分析法,抗氧化

茶多酚是一种天然无毒的抗氧化剂,具有高效的抗氧化、抗衰老、抗癌、抗辐射、防治心血管疾病和捕集体内游离基等功效,在医药保健品、食品、日用化工品等方面有着广泛的应用[1-4]。我国是茶叶生产大国,资源丰富,只有少量茶叶加工成高档商品茶,大量的中低档茶、下脚料、粗老叶被废弃,故开发茶叶新用途,对保护环境、节约能源和创造经济价值都有很大意义[5]。有研究表明,在众多植物多酚中,以葡萄多酚清除自由基能力最强,其显著的抗氧化能力为VE的50倍,VC的20倍左右[6],葡萄多酚还呈有防冠心病、防癌抗癌、抗疲劳、抗炎、抗突变、降血清胆固醇等生物活性[7-8],但目前所研究使用的葡萄多酚多从葡萄籽中提取。我国酿酒葡萄废弃物葡萄皮大部分是作为肥料、饲料或烧材,利用率很低。葡萄酒皮渣数量可观,又具葡萄清香、多酚含量丰富[9],结合两者开发多酚产品,有一定的特色。并有研究表明,不同的天然抗氧剂抗氧化活性有协同增效作用[10-11]。茶多酚、葡萄多酚都不是单一物质,是多酚类及其衍生物的混合物,由于茶多酚和葡萄多酚均为多酚类物质,结构上的相似性,使得他们的理化性质也具有相似性,为了简化提取步骤,节省后续纯化的成本,本研究采用低档茶叶和酿酒葡萄皮渣同步提取多酚,响应面分析法优化提取工艺,大孔树脂纯化总多酚,测定精制总多酚的抗氧化活性,为以后进一步综合利用茶叶和葡萄皮渣提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶叶为市场购买的包装乌龙茶 产地福建安溪；葡萄皮渣 大泽山尹家葡萄酒厂；焦性没食子酸 中国药品生物制品检定所；硫酸亚铁、大孔树脂NKA9 上海润捷化学试剂有限公司；抗坏血酸 天津市百世化工有限公司；铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、过氧化氢 天津市福晨化学试剂厂;酒石酸钾钠 天津市百世化工有限公司；其他试剂均为广州化学试剂厂生产。所有试剂均为分析纯。实验过程用水均为实验室自制蒸馏水。

XMT-7000型数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；B220恒温水浴锅 上海亚荣生化仪器厂；RE52CS型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；UV1102型紫外可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总多酚含量测定 采用酒石酸亚铁法显色可见分光光度法测定多酚含量,主要测定步骤参照文献[12],具体如下:准确吸取25、50、75、100、125mg/mL五种不同浓度的标准溶液1mL,加水4mL,酒石酸亚铁溶液5mL,置于一系列25mL的容量瓶中,用pH7.5的磷酸缓冲液定容。用水代替没食子酸作为对比,在540nm处测定吸光度(A)。所测的吸光度y与对应的没食子酸浓度x绘制标准曲线回归方程为:y=14.54x+0.0133,R2=0.997(R2>0.99),0～0.08mg/mL的范围内与吸光度呈线性相关。样品多酚以茶叶、葡萄皮(质量比1∶1)提取,含量测定方法同上,根据标准曲线算出样品的多酚含量。

1.2.2 总多酚的提取 总多酚提取的单因素实验:分别以乙醇体积分数(v/v,40%、50%、60%、70%、80%、90%)、浸提温度(70、75、80、85、90℃)、浸提时间(30、35、40、45、50min)、液料比(5∶1、11∶1、17∶1、23∶1、29∶1)等4 个因素作单因素实验,考察各因素对多酚提取量的影响,同一实验重复3次。

响应面分析法优化工艺条件:根据Box-Behnken原理,综合单因素实验结果,以总多酚提取量(Y)为响应值,通过响应曲面分析法优化提取条件。选取影响多酚提取量的4个因素乙醇浓度(A)、浸提时间(B)、浸提温度(C)、液料比(D)为自变量,采用四因素三水平共29个实验点的响应面分析实验。同一实验重复3次。

表1 响应面实验因素水平表Table1 The response surface test factors and levels

1.2.3 大孔树脂纯化总多酚 大孔树脂纯化参照文献[13]稍作改动,具体如下:精密称取10g预处理好的NKA9型大孔树脂,装入1.8cm×30cm的层析柱中,上样液体积为60.00mL,上样液多酚浓度为3.04mg/mL,洗脱流速为4.00mL/min,洗脱剂乙醇的浓度为60%。将纯化后的洗脱液与乙酸乙酯按照1∶1的比例混合,搅拌40min,静置40min,分液,取上层液体蒸发溶剂,60℃干燥至恒重。纯化精制后多酚含量由25.54%提高至82.19%,密封备用。

1.2.4 总多酚的抗氧化活性测定 乌龙茶与葡萄皮总多酚溶液的配制:精确称取精制粉末0.05g,用60%乙醇配制得到浓度分别为20.14、40.28、60.42、80.56、100.70、201.39、302.09μg/mL的乌龙茶与葡萄皮总多酚溶液。同法配制抗坏血酸溶液。以下实验采用该系列溶液。

还原力的测定:还原能力的测试参照文献[14],具体如下:分别精密吸取1.00mL以上浓度的乌龙茶与葡萄皮总多酚溶液置10mL的具塞比色管中,依次精密加入2.5mL磷酸盐缓冲液(pH6.6,0.2mol/L)及2.50mL质量分数为1%的K3Fe(CN)6溶液,于50℃的水浴中反应20min后冰浴冷却,并精密加入2.50mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液,以3000r/min离心10min后精密移取上清液5.00mL,并精密加入4.00mL蒸馏水及1.00mL质量分数为0.1%的FeCl3溶液,混合均匀,于10min(以加入0.1%的FeCl3溶液0.5mL时开始计时)后,以蒸馏水调零,以1cm比色皿在波长700nm处测定吸光度,反应物的吸光度越大表示还原力越强,同一实验重复3次。

抗坏血酸溶液还原力测定步骤同上。

羟基自由基清除能力:羟基自由基消除实验参照文献[15]并稍作改动,具体步骤如下:在10mL的具塞比色管中分别精密加入2.00mL浓度不同的乌龙茶与葡萄皮总多酚溶液,再依次精密加入6mmol/L FeSO4溶液2.00mL,6mmol/L水杨酸溶液2.00mL,最后加入6mmol/L H2O2溶液2.00mL启动反应,摇匀,置37℃的水浴中反应30min。以蒸馏水调零,以1cm比色皿在波长510.0nm处测定吸光度Ai,用水代替水杨酸时测得某样品浓度下的光密度Aj,用水代替抗氧化剂时测得空白对照光密度A0。同一实验重复3次。

抗坏血酸溶液羟基自由基消除能力测定步骤同上。

清除率按下式计算:清除率(%)=(1-(Ai-Aj)/A0)×100。

1.3 数据处理

实验数据采用Excel 2003 统计分析,结果用“平均值±标准差”表示,响应面结果采用Design-Expert 8.0.6软件分析。

2 结果与分析

2.1 总多酚提取的单因素实验结果

2.1.1 浸提时间对得率的影响 由图1可知,液料比15∶1,60%乙醇溶液浸提温度75℃条件下,随着提取时间从30min增长至40min,多酚得率从3.82%增加至4.89%,当提取时间超过40min,得率反而下降,随着浸提时间的增长,多酚长时间处于高温下造成部分氧化,使得浸出量下降[16]。因此最佳浸提时间应设定在40min左右。

图1 浸提时间对得率的影响Fig.1 Effect of extraction time on yield of polyphenols

2.1.2 料液比对得率的影响 由图2可知,60%乙醇溶液在浸提温度75℃条件下水浴30min,随着液料比的增大,多酚提取率也增加至4.01%,当液料比达到23∶1(mL/g)之后,再增大料液比提取率又减少到3.84%。植物多酚易与植物组织中的蛋白质、生物碱、多糖、花色苷等物质结合,这种结合阻碍了多酚的浸提,而有机溶剂是结合反应的有效抑制剂。有机溶剂与水的混合液可打断多酚类物质与蛋白质、多糖等物质的结合键,有利于多酚的浸提[17]。料液比的增加会造成浸提液的用量增加,增大了多酚类物质与空气的接触面积,使得其氧化,致使提取率下降,同时料液比过大也会造成溶剂和能源的浪费,并给后续工作带来困难[18]。综合考虑提取率、溶剂用量、后处理,选择液料比23∶1(mL/g)左右为佳。

图2 液料比对得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of polyphenols

2.1.3 乙醇浓度对得率的影响 多酚在植物体内通常与蛋白质、多糖以氢键和疏水键形式形成稳定的化合物,而醇羟基具有氢键断裂能力,有利于使结合态存在的多酚类物质游离出来,因此,复合体系更有利于原料中多酚的提取[19-20]。本实验选择乙醇与水的混合体系作为提取溶剂,不同体积分数的乙醇溶液对多酚类物质得率的影响如图3所示。在其他因素不变的情况下,刚开始随着乙醇浓度的增加,得率也增加,当乙醇浓度达到50%时,提取率最大4.23%,再增加乙醇的浓度,得率反而下降至2.54%,因为高浓度的乙醇会引起多糖、蛋白质等大分子物质的沉淀,导致多酚和这些大分子物质共同沉淀,因此浸出量反而降低[21]。因此,50%乙醇是多酚提取的最佳溶剂。

图3 乙醇浓度对得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of polyphenols

2.1.4 浸提温度对得率的影响 由图4可知,温度升高,提取率增大,因为温度升高,分子热运动增加,加速了溶质向溶剂的扩散速率；因实验条件限制以及温度过高引起乙醇挥发迅速等原因,从提取率和节约能源两方面考虑,提取温度90℃为宜。

图4 温度对得率的影响Fig.4 Effect of temperature on yield of polyphenols

2.2 响应面分析法优化工艺条件

2.2.1 响应面设计及结果分析 响应面实验设计及结果见表2。表3对实验数据进行方差分析。

表3 响应面优化软件方差分析数据表Table3 Analytical data of results of response surface optimization

根据表3可分析得出,模型的p值<0.0001,表明该模型具有统计学意义；方差分析的结果表明,A,B,C,D,CD,BC,A2,B2,C2,D2都是模型的显著因素,四个因素对多酚提取率的影响大小依次为D>A>C>B。失拟差p>0.05,表明方程模型失拟不显著,拟合效果较好,可用回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。多元拟合回归方程为:

提取率=4.71-0.15A+0.096B-0.14C+0.17D-0.23A2-0.51B2-0.22C-0.23C2+0.20CD-0.16D2

表2 响应面优化实验设计与结果Table2 Experimental results of response surface optimization

续表

由回归方程得出的最优条件为乙醇浓度48.57%,浸提时间40.49min,浸提温度88.31℃,液料比21.91∶1(mL/g),最大预测得率应为4.79%。

2.2.2 最佳工艺条件的预测和检验 为方便实际操作,将工艺参数修订为乙醇浓度48%,浸提时间 40min,浸提温度 88℃,液料比22∶1(mL/g)。在此条件下进行验证实验,得率实验值为4.76%,相对误差为0.62%,与预测值接近,说明此实验结果较为可靠,模型是有效的。

2.3 乌龙茶与葡萄皮总多酚抗氧化活性的测定结果

2.3.1 还原力的测定结果 如图5所示,随着浓度的增加,吸光值也在逐渐增大,在实验浓度范围内,相同浓度下,多酚的还原能力明显强于抗坏血酸。马宇平等[22]研究表明,当浓度为50、100、200μg/mL时,葡萄皮多酚的还原力吸光值分别为0.15、0.22、0.37；颜栋美等[23]研究表明,当浓度为50、100、200μg/mL时,茶多酚的还原力吸光值分别为0.20、0.41、0.70。本实验结果表明,当浓度为20、40、80μg/mL时,总多酚的还原力吸光值分别为0.56、0.72、0.78,在一定浓度范围内,总多酚的还原力明显优于同浓度的上述葡萄多酚或茶多酚的还原能力。可能是葡萄多酚与茶多酚存在协同作用而增强了还原力。

图5 还原能力Fig.5 Reduction ability

2.3.2 羟基自由基清除率测定的结果 由图6得知,抗坏血酸对·OH的抑制率达50%时的浓度IC50为134.22μg/mL远远大于总多酚IC5017.60μg/mL,故羟基自由基的清除能力抗坏血酸小于总多酚,随着浓度的提高,两者的清除率均在增大。杜晓等[24]报道,炒青叶茶多酚对·OH的抑制率达50%时的浓度(IC50)为90.00mg/L；谢贞建等[25]研究得出,普洱茶提取物的IC50为31.13μg/mL,绿茶提取物的IC50为49.36μg/mL；孙静涛等[26]研究发现,葡萄皮渣多酚消除羟自由基IC50为380μg/mL。本实验总多酚IC5017.60μg/mL,优于葡萄皮多酚或茶多酚。可能是茶多酚与其它抗氧化剂存在协同抗氧化作用,协同作用的机理是通过基于氧化还原电位差的偶联氧化[27]。

图6 对羟基自由基的清除Fig.6 Scavenging rate of hydroxyl radical

3 结论

乙醇水浴辅助提取总多酚,通过单因素实验和响应面分析优化得到的提取多酚的最佳工艺条件为乙醇浓度48%,浸提时间40min,浸提温度88℃,液料比22∶1(mL/g)的恒温水浴提取2次,得率可达4.76%,与预测值之间的相对偏差较小,证明响应面法优化得到的提取工艺科学合理,具有一定的实用意义。

乌龙茶与葡萄皮总多酚的体外抗氧化活性研究表明,总多酚具有较强的自由基清除力及还原能力,在一定浓度范围内,其抗氧化能力大于抗坏血酸。至于将分别提取的多酚混合,抗氧化活性会怎样变化,不同来源的多酚如何发挥协同作用等,将有待进一步研究。

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Extraction,purification and antioxidant activity of total polyphenols from tea and grape skin

YI Yun-hong1,ZHANG Min-juan2,LV Jun-liang1,ZHANG Dan-hong1,WU Gong-qing1,*

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guangdong Pharmaceutical University,Zhongshan 528458,China；2.Fundamentals Department of Zhengzhou Trade and Industry School,Zhengzhou 450007,China)

This study used oolong tea and grape skins as the research object. On the basic of single factor experiment,the extraction conditions of polyphenols from tea and grape skin were optimized by response surface methodology(RSM). Under the condition of liquid to solid ratio of 22∶1(mL/g),ethanol concentration of 48%(v/v)as solvent,at the temperature of 88℃,extraction time of 40min,the average extraction yield of polyphenols was 4.76%,compared to the theoretical value,the relative error of 0.62%. Optimized by response surface regression equation had some practical significance.After purification by NKA9 type macroporous resin,polyphenol content increased from 25.54% to 82.19%. The antioxidant activities of the purified polyphenols and VCwere evaluatedinvitroby hydroxyl free radical elimination ability and reducing power,respectively. The results showed that the hydroxyl free radical elimination ability and reducing power of the purify polyphenols are better than that of the same concentration of VC.The total polyphenols had ·OH elimination rate of 50%(IC50)when the concentration of total polyphenols 17.60μg/mL. The results showed that the total polyphenols can be used as a source of potential antioxidant.

oolong tea;grape skin;polyphenols;response surface methodogy;antioxidant activity

2014-08-20

易运红(1979-)，硕士，实验师，主要从事中药化学和有机化学的教学与研究。

TS209

B

:1002-0306(2015)09-0229-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.041

*通讯作者:吴功庆(1979-)，博士，实验师，主要从事生物化学的研究。