一株产耐高温碱性脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化

杜萍萍,张莹莹,申培立,李志辉,于宏伟,卢海强,苏旭东,张 伟,檀建新

(河北农业大学食品科技学院,河北省农产品加工工程技术中心,河北保定 071001)



一株产耐高温碱性脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化

杜萍萍,张莹莹,申培立,李志辉,于宏伟,卢海强,苏旭东,张 伟,檀建新*

(河北农业大学食品科技学院,河北省农产品加工工程技术中心,河北保定 071001)

用Tween平板法从采集自河北省的122份土样中筛选到一株脂肪酶活性较高的菌株Lipa1318。综合其形态学和生理生化特征以及16S rDNA的序列比对结果,确定该菌株为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。其所产胞外脂肪酶的最适反应温度为60℃,最适pH为8.0,是一种耐热的碱性脂肪酶。摇瓶发酵实验证明该菌株的最适产酶条件为:葡萄糖1.0%,牛肉膏1.0%,TritonX-100 1.5%,橄榄油0.50%,CaCl20.50mmol/L,发酵液初始pH为8.0,30℃培养96h,通过发酵条件的优化使酶活提高了3.6倍。

脂肪酶,粘质沙雷氏菌,发酵条件

脂肪酶(EC 3.1.1.3),又称三酰甘油酰基水解酶,是一类水解长链脂肪酸甘油酯生成游离脂肪酸和甘油的界面酶[1]。脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中,微生物脂肪酶种类最多,广泛存在于细菌、酵母和霉菌中。与动、植物脂肪酶相比,微生物脂肪酶有适宜大规模生产、易分离提取、具有更广的pH、温度适应性等特点,是工业用脂肪酶的重要来源[2],广泛应用于食品、制革、饲料、洗涤和油脂化工等工业领域[3]。

随着科技发展和应用的需要,耐极端条件(如低温、高温、酸、碱等)脂肪酶的研究已成为该领域的重要方向。耐高温脂肪酶可用于酶催化制备生物柴油,减少温度对催化的反应的限制[4]。碱性脂肪酶广泛应用在洗涤工业中,可以显著提高洗衣粉的洗涤效果,尤其是去除黄斑的效果。在食品工业中添加脂肪酶可缩短乳酪熟成时间,增强乳酪及奶油的风味,生产健康的脂类食品。

目前脂肪酶是作为工业催化剂用途最广的酶,但其市场完全被国外少数公司垄断,其中丹麦Novo公司占有约80%市场[5]。国内,脂肪酶的需要主要依赖于进口[6]。因此,脂肪酶具有重要的研究和开发价值。

本文从122份土样中筛选到一株酶活较高的菌,通过生理生化鉴定和16S rDNA鉴定,确定为粘质沙雷氏菌(S.marcescens)。实验证明其所产脂肪酶为耐热碱性脂肪酶。对其产酶条件进行了优化,这为扩大脂肪酶的菌种资源及后续的特征研究和生产应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

从河北省保定市,石家庄市及沧州市肉联厂,河北农业大学学校附近等油污丰富的土壤淤泥中采集122份土样。DNA Ladder Marker,p-MD-19T,Taq DNA聚合酶,PCR试剂,DNA回收试剂盒,质粒提取试剂盒均购自TaKaRa公司,对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP),对硝基苯酚(p-NP)等生化试剂均购自sigma试剂公司；基础培养基:Luria-Bertani(LB)培养基[7]；筛选培养基:Tween-80琼脂平板及橄榄油油脂同化平板的配制参见文献[8-9]。发酵培养基(%):胰蛋白胨1.0,NaCl 1.0,酵母粉0.50,TritonX-100 0.10,富集液 0.80,调pH到8.0,121℃灭菌20 min；富集液(%):(NH4)2SO40.10,K2HPO40.10,KCl 0.050,MgSO4·7H2O 0.050,FeSO4·7H2O 0.0010,每5mL富集液加入150μL乳化油。

SW-CJ-1D型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司；YX280B不锈钢手提压力灭菌锅 上海安锐自动化仪表有限公司；ZHWY-2102C恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；SHP-250型生化培养箱 上海精宏实验设备公司；ALC-210.4电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；PB-20 pH计 上海理达仪器厂；DYY-8C电泳仪 北京六一仪器厂；BINDA 2020D凝胶成像系统 北京宾达英创科技有限公司；SP-756 P紫外可见分光光度计 北京叶之恒科技有限公司；H-1850R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的筛选 初筛:取1g土样于5mL富集液中,30℃,200r/min培养48h后,取100μL菌液用无菌水进行梯度稀释102倍,取100μL涂布于Tween-80培养基平板中,30℃恒温箱中倒置培养48h,选择周围产生白色沉淀圈的菌落。以菌落直径与沉淀圈直径之比作为初筛依据,将沉淀圈比值较大的菌株保存于LB斜面上以备进一步复筛。

复筛:将初筛到的菌株接种于油脂板上,30℃恒温箱中培养3d,观察菌落产生的透明圈的大小。挑取透明圈较大的菌株进行酶活力的测定。

1.2.2 脂肪酶酶活力的测定 采用改良的Winkler和Stuckman p-NPP比色法[10]。以p-NP溶液制备标准曲线[11]。将油脂板复筛中透明圈较大的菌株接种于发酵培养基中,30℃,200r/min培养4d。取1mL菌液12000r/min离心1min,收集上清即为粗酶液。

取1mmol/L p-NPP和50mmol/L pH8.0的Tris-HCl溶液各1mL,并在一定温度下保温10min,加入100μL粗酶液保温15min,最后定容至5mL,在425nm下测定溶液OD值,以加热灭活的酶液做空白对照。在上述实验条件下以每分钟水解生成1μmol对硝基苯酚所需酶量定义为一个脂肪酶活力单位(μmol/min)。

1.2.2.1 粗酶液最适温度及pH的确定 将粗酶液在30～70℃(间隔为5℃)和pH6.0～11.0(间隔1pH单位)的范围内测定脂肪酶的活力以确定最适的酶活反应温度和pH。

1.2.3 产酶菌株的鉴定

1.2.3.1 形态学观察和生理生化实验 形态学观察:将纯化的菌株Lipa1318转接入LB固体培养基中30℃培养24h观察菌落形态和菌体形态。

生理生化实验:参照《伯杰细菌鉴定手册》[12]的鉴定方法对菌株Lipa1318进行生理生化鉴定。

1.2.3.2 16S rDNA 序列系统进化树 按文献[13-14]提取菌株Lipa1318基因组作为PCR模板。用16S rDNA通用引物5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′扩增16S rDNA。扩增反应体系为:2μL模板DNA,上下游引物各1μL,2×EsTaq MasterMix 10μL,H2O 6μL。PCR反应条件:94℃,预变性10min；94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸90s,30个循环,72℃延伸5min。PCR产物经胶回收、连接、转化、质粒提取验证后由华大基因公司测序。将菌株Lipa1318的16S rDNA序列经GenBank的BLAST检索进行系统发育分析,用MEGA 4.1软件构建系统发育树[15]。

1.3 产酶条件的优化

1.3.1 不同碳源对产酶的影响 以发酵培养基为基础,以1.0%的胰蛋白胨为氮源,分别以1.0%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉、糊精,麦芽糊精,橄榄油,麦芽糖,玉米浆,柠檬酸为碳源,考察其对脂肪酶活力的影响。

1.3.2 不同氮源对产酶的影响 以发酵培养基为基础,以1.3.1中所测最佳物质为碳源,分别以1.0%的酵母粉、牛肉膏、硫酸铵、氯化铵,黄豆粉,蚕蛹粉,胰蛋白胨,酵母粉+硫酸铵,蛋白胨+硫酸铵及尿素为氮源,进行最适氮源的筛选。

1.3.3 金属离子对产酶的影响 以1.3.1中最适碳源和1.3.2中最适氮源代替发酵培养基中的碳源及氮源,考察加入不同浓度(0.25、0.50、1.0、1.5mmol/L)的金属离子(Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Mg2+)对菌株产脂肪酶的影响。

1.3.4 表面活性剂对产酶的影响 改变发酵培养基成分,以所测最适碳氮源代替发酵培养基中碳源及氮源,同时添加1.3.3所优化的最适金属离子,考察不同浓度(1.0%、1.5%、2.0%、4.0%)表面活性剂(Tween-80,Tween-20,SDS,TritonX-100)对产酶的影响。

1.3.5 不同诱导物对产酶的影响 按上述优化好的碳氮源,金属离子,表面活性剂对发酵培养的成分进行调整,选取葵花籽油,花生油,橄榄油,大豆油,玉米油为诱导物,考察其对菌株产脂肪酶的影响。每种油脂设四个浓度(0.50%、1.0%、2.0%、4.0%)。

表1 不同菌株的产酶活力Table1 Lipase activity of different isolates

注:数据为3次平均值+标准偏差。

表2 菌株Lipa1318生理生化特征Table2 Physiological and biochemical characters of the strain Lipa1318

注:+表示反应阳性；-表示反应阴性。

1.3.6 初始pH对产酶的影响 在上述最适碳源、氮源、金属离子、表面活性剂及诱导物下,考察发酵培养基在不同初始pH下(5.0,6.0,7.0,8.0,9.0)对酶活性的影响,以确定最适的初始pH。

1.3.7 发酵时间对产酶的影响 在上述优化好的发酵培养基中对菌株进行培养,接种量为4.0%,30℃,200r/min培养。从12h之后开始,每隔12h取样一次,测定菌株的生长曲线及其相应酶活。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

将来自河北省各地的122份土样用吐温平板法初筛得到57株产脂肪酶的菌,再通过油脂板复筛得到37株菌。通过p-NPP法测定菌株活性,菌株活性较高的有13株(表1)。将酶活较高的13株菌点接种于吐温板上,结果显示菌株Lipa1318的沉淀圈最大(图1)。将菌株Lipa1318接种于发酵培养基中,30℃,200r/min培养4d。测定其粗酶液酶活性为2.56U/mL。

图1 产脂肪酶菌株在吐温板上形成的沉淀圈Fig.1 The opaque zone performed by the lipase producing isolates on Tween-80 agar

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 形态学及生理生化鉴定 菌株Lipa1318在固体LB中30℃培养24h后,菌落淡黄色,中心凸起不透明,边缘不规则,表面湿润。革兰氏染色阴性,单个菌体在电子显微镜下观察为近球形短杆状,无芽孢。按文献[16]进行生理生化鉴定,结果见表2,综合菌落和菌体形态特征、生理生化特征将其归为粘质沙雷氏菌属。

2.2.2 16S rDNA鉴定 以Lipa1318的基因组为模板进行16S rDNA的PCR扩增,扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶的1600bp处有一条带,与预测片段大小一致,表明片段扩增正确(图2)。将PCR产物克隆后测序,并在Genbank中进行Blast比对,结果表明菌株Lipa1318与S.marcescens的同源性为99%,而与其他细菌的亲缘关系较远,根据其16S rDNA比对结果使用MEGA 4.1软件构建系统进化树见图3。结合形态学和生理生化鉴定结果证明该菌株为粘质沙雷氏菌(S.marcescens)。

图2 16S rDNA的PCR扩增产物Fig.2 Agarose gel analysis of PCR product of 16S rDNA注：Lane1:Lipa1318; Lane2:1kb DNA Ladder。

2.3 Lipa1318粗酶液的最适温度和pH

在30～70℃和pH6.0～11.0的范围内测定菌株Lipa1318的粗酶液脂肪酶的活力,由图4结果可以看出该酶作用的最适温度为60℃,最适pH为8.0,酶活为3.56U/mL,表明该酶是一种耐高温碱性脂肪酶。

图3 菌株Lipa1318的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain Lipa13118

图4 酶作用的最适温度及pHFig.4 The optimal temperature and pH of lipase

2.4 菌株Lipa1318产酶条件的优化

2.4.1 碳源和氮源对产酶的影响 在发酵培养基的基础上,对Lipa1318的碳源和氮源进行了筛选。从图5可以看出,10种碳源对的产酶能力影响差异较大,其中葡萄糖和柠檬酸钠能促进脂肪酶的产量,因此选取1.0%的葡萄糖为最适碳源。由图6可知,菌株Lipa1318对有机氮源的利用效率要远高于无机氮源,且氮源为1.0%的牛肉膏时脂肪酶活力最高,因此确定其为最适氮源。

图5 不同碳源对产酶的影响Fig.5 Effect of different carbon sources on lipase production

图6 不同氮源对产酶的影响Fig.6 Effect of different nitrogen sources on lipase production

2.4.2 金属离子对产酶的影响 研究表明近三分之一已知酶的活性需金属离子参与[11]。以发酵培养基为对照(酶活性为2.56U/mL),由图7可知,Mn2+对菌株Lipa1318的产酶能力有明显的抑制作用。0.50mmol/L的Ca2+、Cu2+可增强菌Lipa1318产酶能力,但Zn2+、Fe3+、Mg2+对产酶的影响不大。因此,选取0.50mmol/L的Ca2+为最适金属离子浓度。

图7 金属离子对产酶的影响Fig.7 Effect of different metal ion on lipase production

2.4.3 表面活性剂对产酶的影响 表面活性剂可以降低培养基的表面张力,改变细胞膜的通透性,从而有利于细胞有毒代谢产物如乳酸等排出胞外,刺激细胞生长[17]。表面活性剂还能改善氧在气液界面的传递速度进而增加产酶量。以发酵培养基为对照(酶活性为2.56U/mL),如图8所示的4种表面活性剂中,TritonX-100的效果普遍优于其他表面活性剂。1.5%的TritonX-100可使酶活提高7.90U/mL。SDS及Tween-20对菌株的产酶能力有抑制作用。

图8 表面活性剂对产酶的影响Fig.8 Effect of different surface active agents on lipase production

2.4.4 诱导物对产酶的影响 在培养基中添加合适的诱导物可有效刺激微生物的产酶量。本实验选取葵花籽油,花生油,橄榄油,大豆油,玉米油为诱导物,每种油脂设四个浓度(0.50%,1.0%,2.0%,4.0%)。以发酵培养基为对照(酶活性为2.56U/mL),如图9所示,一定浓度的橄榄油和玉米油均对产酶有一定的促进作用。体积分数为0.5%的橄榄油可有效刺激菌株S.marcescensM1318产脂肪酶,且酶活提高到6.43U/mL。体积分数为2.0%的玉米油可将酶活提高到6.07U/mL。因此选取0.50%的橄榄油为最适诱导物。

图9 不同油脂对产酶的影响Fig.9 Effect of different oils on lipase production

2.4.5 初始pH对产酶的影响 合适的培养基pH可有效增加菌株产酶量。由图10可知,初始pH为8.0时脂肪酶活力最高,酶活可达到9.16U/mL。在酸性条件下菌株的生长受到一定抑制,因此酶活力较低。

图10 初始pH对产酶的影响Fig.10 Effect of initial pH on lipase production

2.4.6 发酵时间对产酶的影响 按4.0%接种量接种于优化后的发酵培养基中,30℃,200r/min培养,图11为发酵液中相对生物量%(以发酵液在12h的OD600为标准即为100%)和脂肪酶活力变化的结果。0～12h为生长停滞期,12～48h为对数生长期,48～96h为稳定期,96h后为衰退期。结合产酶曲线来看,发酵24h后开始产酶,随着菌体数量的增加酶活也在逐渐增加。进入稳定期后菌体数量基本不变,此时酶活增加最快。在稳定期后期酶活达到最大,为9.16U/mL。出现这种现象的原因可能是因为菌株Lipa1318所产脂肪酶为胞外酶,该酶在细胞内合成且释放到培养基中需要一定时间。进入稳定期后菌体数量达到最大,因此酶活增加速度变大。进入稳定期后期,菌体开始裂解,胞内的酶系得到释放,脂肪酶的活力达到最大。但随着菌体的裂解,胞内的蛋白酶可能也释放到培养基中,这导致进入衰退期后脂肪酶活力的下降。因此,最适的发酵时间为96h。

图11 菌株Lipa1318脂肪酶发酵曲线Fig.11 Fermentation curve of lipase activity from Lipa1318

3 结论与讨论

本文筛选到一株酶活较高的菌株Lipa1318。通过形态学,生理生化实验,16S rDNA序列比对分析的方法,确定该菌株为S.marcescens。对该菌株的产酶条件进行优化,结果显示该菌的最佳发酵产酶条件为:碳源为1.0%葡萄糖,氮源为1.0%牛肉膏,以1.5%TritonX-100作为表面活性剂,以0.50%橄榄油为诱导物,0.50mmol/L CaCl2,培养基的初始pH为8.0,30℃条件下培养96h。对S.marcescensM1318 所产的胞外脂肪酶进行研究,结果显示,该酶的最适反应温度为60℃,最适pH为8.0,是典型的中度耐高温碱性脂肪酶。

粘质沙雷氏菌是重要的脂肪酶产生菌,它所产的脂肪酶不仅可以合成冠状动脉血管扩张剂地尔硫卓的手性前体[18],而且具有在有机溶剂中稳定性好、广泛的底物特异性和异构体选择性等特性[15],还可以用于转酯化反应生产生物柴油。

就产脂肪酶细菌而言,研究最多的为假单胞菌属(Pseudomonas),而粘质沙雷氏菌的研究相对较少。蓝卉[5]等筛选到的S.marcescensSYBC Y-R菌株的酶活最高可达1.07U/mL。刘义[19]等报道的菌株S. sp. HS-L5的酶活为1.5U/mL。本实验筛选到的菌株Lipa1318的酶活可达9.16U/mL,因此,该菌株作为出发菌株在脂肪酶生产方面具有一定开发潜力。另外,已报道的产生热稳定性良好脂肪酶的微生物中关于粘质沙雷氏菌的报道较少。邹文欣[20]等报道S.liquefaciensS33的最适反应温度为44℃,pH为8.0。王利群[15]等筛选到一株脂肪酶菌株S. sp. CF-12在40℃,pH为8.0时酶活最高。李长春[21]等报道的S.marcescensSLP-1的最适酶促反应温度为50℃。与以往报道的粘质沙雷氏菌脂肪酶相比,Lipa1318所产脂肪酶的最适酶促反应温度为60℃,pH为8.0,有别于上述菌株,具有很好的开发潜力。

[1]Jaeger K E,Eggert T. Lipases for Biotechnology[J].Current Opinion in Biotechnology,2002,13(4):390-397.

[2]汪小锋,王俊,杨江科,等.微生物发酵生产脂肪酶的研究进展[J].生物技术通报,2008,47-53.

[3]刘海洲,吴小飞,牛佰慧,等.脂肪酶在食品工业中的应用与研究进展[J].粮食加工,2008,33(5):55-57.

[4]肖海群.脂肪酶产生菌的选育及其发酵条件的研究[D]. 南昌:南昌大学,2007.

[5]蓝卉,蔡宇杰,廖祥儒,等.一株低温脂肪酶产生菌的筛选鉴定与产酶发酵初探[J].食品与生物技术学报,2009,28(4):550-554.

[6]李军红,姜绍通,童洋洋.产脂肪酶真菌的筛选及产酶条件优化[J].安徽农业科学,2011,39(26):15840-15842.

[7]Sambrook J,Frish E F,Maniatis T. Molecular Cloning:A laboratory Manual(Second Edition)[M]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,903.

[8]伍康荣,邓璐璐,杨锐旺,等.脂肪酶产生菌的分离、鉴定及其发酵条件优化[J].广东农业科学,2012,100-102.

[9]Choo D W,Kurihara T,Suzuki T,et al. A cold adapted lipase of an Alaskan psychographPseudomonasp. strain B11-1:Gene cloning and enzyme purification and characterization[J]. Applied and Environmental Microbiology,1998,64(2):486-491.

[10]Winkler U,Stuckmann M. Glycogen,hyaluronate,and some other polysaccharides greatly enhance the formation of exo-lipase bySerratiamarcescens[J]. Journal of Bacteriology,1979,138:663.

[11]郄晓莎.低温脂肪酶高产菌株的筛选、鉴定及其发酵产酶条件的优化[D]. 保定:河北农业大学,2007.

[12]布坎南 R E,吉本斯 N E. 《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)[M].北京科学出版社,1984:452-454.

[13]方珊,刘浩浩,李华林,等.新型脂肪酶基因的克隆与表达[J].食品与药品,2013,15(1):15-17.

[14]肖冬.低温脂肪酶产生菌Trichosporonpullulans的脂肪酶基因克隆[J].化学与生物工程,2012,29(6):71-76.

[15]王利群,汪庆,何玉财,等.一株脂肪酶产生菌及其脂肪酶催化性质的初步研究[J].化工进展,2012,31(3):642-648.

[16]闫云君,舒正玉,杨江科.细菌脂肪酶的结构和功能研究进展[J].食品与生物技术学报,2006,25(4):121-126.

[17]赵伟,王俐琼,郑甲，等.产脂肪酶菌株的分离、鉴定及其产酶条件优化[J].湖南师范大学自然科学学报,2010,33(3):88-92.

[18]李志明.《食品卫生微生物检验学》[M].化学工业出版社,2009:24-25.

[19]刘义,孟丽君,楼梦,等.1株脂肪酶产生菌的筛选鉴定及其脂肪酶基因的克隆表达[J]. 华中师范大学学报(自然科学版),2011,45(3):444-449.

[20]邹文欣,刘慧,郁文焕.脂肪酶产生菌Serratialiquefaciens的分离及其酶性质的研究[J].南京大学学报,1996,32(4):713-716.

[21]李长春.碱性脂肪酶高产菌Serratiasp. SL-11的筛选及酶的分离纯化与部分性质研究[D]. 重庆:西南大学,2006.

Screening of a thermosTablealkaline lipase producing strain and optimization of fermentation condition for Lipase production

DU Ping-ping,ZHANG Ying-ying,SHEN Pei-li,LI Zhi-hui,YU Hong-wei,LU Hai-qiang,SU Xu-dong,ZHANG Wei,TAN Jian-xin*

(Engineering Research Center of Hebei Province for Agricultural Products Processing College of Food Science,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

Using the plate assay method with Tween 80 as substrate of lipase,122 soil samples collected from Hebei province were screened and a bacterial strain Lipa1318 with high lipase activity was obtained. The results of morphological features,the physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence alignment analysis demonstrated that the isolate wasSerratiamarcescens. The optimal temperature and pH of the extracellular lipase were 60℃ and 8.0,which indicated that the lipase was a thermosTablealkaline lipase. The optimal fermentation condition for high lipase production in flask were as follows:glucose 1.0%,beef extract 1.0%,TritonX-100 1.5%,olive oil 0.50%,CaCl20.50mmol/L,the initial pH(8.0)and temperature(30℃),culture time(96h). Under these conditions,the lipase activity was increased by 3.6 times.

lipase;Serratiamarcescens;fermentation condition

2014-07-24

杜萍萍(1988- )，女，硕士研究生，研究方向：环境微生物学。

*通讯作者:檀建新(1968-)，男，博士，教授，研究方向：微生物资源开发与利用。

多谷物主食冷冻面团的关键技术研究(13227105D);植物多酚类功能性物质对A形成的影响(冀人社字[2010]195号)。

TS201.3

A

:1002-0306(2015)09-0188-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.033