植酸对枯草芽孢杆菌及其噬菌体的作用研究

刘秀侠，穆熙军，赵效南，王 鑫，孙学森，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

植酸对枯草芽孢杆菌及其噬菌体的作用研究

刘秀侠，穆熙军，赵效南，王 鑫，孙学森，谷 巍*

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

通过在培养基中添加不同浓度的植酸，探究了植酸对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)0085和0090菌体生长、芽孢形成的影响及对枯草芽孢杆菌噬菌体P85和P90的抑制效果。结果表明，添加0.150%植酸对其噬菌体P85和P90有明显抑制效果，但影响芽孢的形成；添加0.070%植酸既可以在一定程度上抑制噬菌体P85和P90又不会影响枯草芽孢杆菌及芽孢的生长。

植酸；枯草芽孢杆菌；噬菌体；抑制

植酸具有强螯合能力和抗氧化能力，广泛存在于植物种子、果壳和胚芽中，是一种天然存在的含磷有机化合物。植酸在食品、医疗、化工、冶金和环保等领域有广泛的用途[1]。田小海[2]经毒理实验研究发现，植酸可以提高小鼠的免疫力。植酸具有抗癌[3]、降血糖、预防大鼠心肌梗塞[4]等作用。作为一种非离子表面活性剂，植酸可加快营养物质的消耗，促进发酵菌体的生长。丁筑红等[5]研究发现，添加植酸可缩短酵母菌的发酵周期，促进酵母菌的增殖。作为金属离子的螯合剂，植酸对钙、镁及微量元素锌、铁等均有螯合影响[6]。彭益强等[7]通过抑菌实验研究发现，植酸对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的最小抑制浓度分别为1.0%、0.5%、0.5%和0.125%，说明枯草芽孢杆菌对植酸溶液较不敏感。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是广泛分布于土壤、水和空气等各种不同环境中产芽孢好氧型革兰氏阳性细菌[8]，1999年我国农业部正式批准使用其作为益生菌。枯草芽孢杆菌是饲料添加剂上常用的饲用微生物，摄入机体后可提高动物免疫力[9]、消化酶活性、日增重，显著降低粪便中的大肠杆菌和梭状芽孢杆菌的数量[10]，提高生产性能[11]等。枯草芽孢杆菌在食品安全（如降解农业杀虫剂[12]）、环境保护（如降解石油[13]）等方面表现出较好的作用效果。枯草芽孢杆菌对培养基的营养要求简单，可直接利用低成本的菜籽粕作为氮源[14]。

在枯草芽孢杆菌发酵生产中噬菌体的感染现象非常普遍，UMENE K等[15]从纳豆生产工厂分离得到侵染枯草芽孢杆菌发酵导致发酵中断的PM1噬菌体。针对微生物发酵生产过程中存在的噬菌体污染难题，国内外多采用如氧化剂和季铵化合物等化学消毒剂对噬菌体污染的工业厂房和研究实验室进行环境消毒[16]、膜过滤或紫外光照射与热处理结合处理噬菌体污染的发酵液[17]及柠檬酸盐或磷酸盐[18]等金属离子螯合剂抑制噬菌体等方法[19]。噬菌体侵染宿主菌的过程中需要金属离子[20]，而植酸具有强螯合金属离子的性能。本文研究了植酸对枯草芽孢杆菌菌体生长、芽孢形成的影响及对噬菌体的抑制效果，通过分光光度计分别测培养5 h和21 h菌液的OD600nm值，用SPSS 16.0软件对实验数据进行单因素方差分析，研究植酸在抑制枯草芽孢杆菌噬菌体方面的可实用性，为应用植酸提高枯草芽孢杆菌及其他工业微生物抗噬菌体特性提供了一定的参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）0085及0090：山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院；枯草芽孢杆菌噬菌体P85和P90：山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院基因工程研究室。

氢氧化钠（分析纯）：天津凯通化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母浸膏：天津市英博生化试剂有限公司；琼脂：北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖：山东祥瑞药业有限公司；植酸：美国Aladdin公司。

枯草芽孢杆菌液体培养基：1%氯化钠、1%蛋白胨、0.5%酵母浸膏、0.2%葡萄糖，调pH 7.0。

1.2 仪器与设备

THZ-C恒温振荡器：苏州培英实验设备有限公司；DHP-9012电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；S22PC型可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BCD-196TMPI冰箱：青岛海尔股份有限公司；JJ300型电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；YXQG02手提式压力蒸汽灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司。

1.3 方法

挑取斜面保存的枯草芽孢杆菌至10 mL液体培养基中，37℃摇瓶培养16 h，以2%比例转接至数支新的10 mL液体培养基中，37℃摇瓶培养5 h，随机分配到数个处理组，每组3个平行，37℃继续摇瓶培养至21 h，用分光光度计在波长600 nm条件下测定菌液的OD600nm值，试验结束后对植酸的抑菌效果进行单因素方差分析。对试验结果OD600nm值采用SPSS 16.0软件中的Duncan新复极差检验法进行单因素方差分析，对差异显著的数据进行多重比较。P＜0.05表示有显著性差异，数值以“平均值±标准差”来表示。

植酸的处理方法：用超纯水将植酸的浓度由50%稀释至10%，0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱保藏待用；在培养0、5 h及15 h的10 mL枯草芽孢杆菌菌液中，添加10%植酸70 μL、150 μL，使植酸的终浓度分别为0.070%、0.150%。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌镜检及活菌计数

枯草芽孢杆菌0085和0090在10 mL液体培养基中37℃摇瓶培养5 h、21 h，油镜镜检结果如图1所示。由图1可知，培养5h的枯草芽孢杆菌0085和0090均为杆状菌体（见图1A及图1D）；培养21 h的枯草芽孢杆菌0085和0090多数形成芽孢（见图1B及图1E）；延长培养时间芽孢会脱落（见图1C及图1F）。取1mL枯草芽孢杆菌0085和0090菌液活菌计数，由计数结果可知，培养5h的活菌数分别为1.87×108CFU/mL和1.92×108CFU/mL；培养21h活菌数分别为9.33×108CFU/mL和9.45×108CFU/mL。因此，枯草芽孢杆菌0085和0090在10 mL液体培养基中37℃摇瓶培养5 h活菌数已达到将近2×108CFU/mL；培养21 h活菌数可达到将近109CFU/mL，此时基本全部形成芽孢。结合公司发酵生产的实际情况，考虑到这两个时间点具有代表意义。因此，本研究选择培养5 h及21 h取菌液测OD600nm值。

2.2 植酸（0.025%～0.200%）对枯草芽孢杆菌及其噬菌体的影响

向培养0、5 h的枯草芽孢杆菌0085和0090中分别添加噬菌体P85和P90（终效价均为107pfu/mL），同时添加过滤除菌植酸（终浓度为0.025%～0.200%），37℃摇瓶培养至21 h，测OD600nm值，结果见表1。由表1可知，在培养5 h的枯草芽孢杆菌0085和0090中加入终浓度为0.100%～0.200%的植酸后，摇瓶培养至21 h对菌株的生长均有影响，其中对0085菌株无显著影响（P＞0.05），对0090菌株有显著影响（P＜0.05）；0.050%～0.200%的植酸对噬菌体P85和P90的抑制作用均达到显著程度（P＜0.05），其中添加终浓度为0.150%植酸对噬菌体P85和P90的抑制作用最好。因此，当枯草芽孢杆菌0085和0090菌液在培养过程中出现噬菌体P85和P90污染时，可以考虑添加终浓度为0.15%植酸抑制噬菌体P85和P90。

植酸具有与金属螯合的24个氧原子、12个羟基和6个磷酸基，可与Ca2+、Mg2+、Fe2+和蛋白质结合[20]。作为一种少见的金属多齿螯合剂，植酸会影响枯草芽孢杆菌的正常生长。由表1可知，在转接菌液的同时添加0.100%～0.200%植酸对枯草芽孢杆菌0085和0090菌株的生长均有显著抑制作用（P＜0.05）；接菌的同时添加0.025%和0.050%植酸对培养5 h和21 h的枯草芽孢杆菌0085和0090均无抑制作用，OD600nm值与对照菌液相比差异显著（P＜0.05），对噬菌体的抑制作用也达到显著程度（P＜0.05），但是OD600nm值较小，活菌数达不到实际生产的需要。因此，接菌的同时添加＞0.100%浓度的植酸会影响枯草芽孢杆菌的生长，添加＜0.100%浓度的植酸不能很好的抑制噬菌体侵染宿主菌，植酸适宜浓度需要进一步试验确定。

2.3 植酸（0.050%～0.100%）对枯草芽孢杆菌及其噬菌体的影响

选择0.050%～0.100%植酸，目的是寻找对宿主菌的生长无抑制作用，同时对噬菌体的生长有较好的抑制作用的植酸浓度。在转接枯草芽孢杆菌0085和0090至10 mL液体培养基的同时添加终浓度分别为0.050%～0.100%的植酸，培养5 h分别添加噬菌体P85（终效价为107pfu/mL），37℃摇瓶培养至21 h，在5 h及21 h时分别取菌液测OD600nm值，结果见表2。由表2可知，添加0.050%～0.070%植酸组培养至21h菌液的OD600nm值稍高于对照，且差异显著（P＜0.05），姚露燕等[21]研究表明，金属离子浓度大小会影响枯草芽孢杆菌的活菌数和芽孢率，推测可能低浓度的植酸螯合一定金属离子后反而更有利于枯草芽孢杆菌的生长；0.080%～0.100%植酸对枯草芽孢杆菌0085菌株的生长有显著抑制影响（P＜0.05）；0.07%植酸对效价为107pfu/mL的P85噬菌体有一定的抑制作用。因此，在噬菌体侵染不是特别严重的情况下，添加0.07%过滤除菌的植酸既不会影响枯草芽孢杆菌的生长，又能在一定程度上抑制噬菌体侵染宿主菌。

2.4 0.150%的植酸对枯草芽孢杆菌芽孢形成的影响

在发酵生产过程中，常会出现芽孢杆菌形成芽孢前后突然出现其噬菌体感染，从而导致发酵菌体变稀甚至菌体全无的现象，造成时间及资源的浪费。因此，本研究在枯草芽孢杆菌0085和0090形成芽孢前（约15 h）添加植酸与其噬菌体，检测植酸是否会影响芽孢的形成。由表1可知，0.150%植酸可以很好的抑制枯草芽孢杆菌噬菌体P85和P90侵染裂解宿主菌。在枯草芽孢杆菌0085和0090培养至15 h时添加浓度为0.150%的植酸和终效价为107pfu/mL的噬菌体P85和P90，油镜镜检如图2所示。由图2可知，在噬菌体和0.15%植酸存在时，枯草芽孢杆菌0085和0090菌株在21 h基本全为杆状菌体（见图2A及图2C），不能形成芽孢；当延长培养时间至35 h时仍然无芽孢形成（见图2B及图2D），而对照菌株在21h已基本全是芽孢（见图1B及图1E）。由此可知，0.150%植酸虽然能抑制噬菌体P85和P90侵染枯草芽孢杆菌0085和0090，但是也会影响菌株形成芽孢。

3 结论

本实验开展了植酸对枯草芽孢杆菌及其噬菌体的影响研究。不同浓度的植酸（0.050%～0.200%）对枯草芽孢杆菌噬菌体均有一定的抑制作用，其中接菌的同时添加0.070%植酸对宿主菌的生长几乎无影响，对噬菌体有一定的抑制作用；菌液培养5 h及15 h时添加0.150%植酸在抑制枯草芽孢杆菌噬菌体P85和P90方面作用明显；菌液培养15 h时添加0.150%植酸会影响芽孢的形成。总之，在枯草芽孢杆菌出现噬菌体侵染时，添加0.070%植酸既可以在一定程度上抑制噬菌体又不会影响枯草芽孢杆菌及芽孢的生长；发酵培养中期及后期，在以获得菌体、菌体分泌表达产物等不以获得芽孢为目的的发酵生产中可以使用0.150%植酸作为枯草芽孢杆菌的噬菌体抑制剂。

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Effect of phytic acid onBacillus subtilisand phages

LIU Xiuxia,MU Xijun,ZHAO Xiaonan,WANG Xin,SUN Xuesen,GU Wei*
(Shandong Baolai-Leelai Bio-Industrial Group,Tai'an 271000,China)

The effect of different concentrations of phytic acid in the medium onBacillus subtilis0085 and 0090 growth,sporulation and inhibiton on B.subtilisphages was investigated.The results showed that adding phytic acid 0.150%had significant inhibitory impact onB.subtilisphages P85 and P90,and affected the formation of spores,adding phytic acid 0.070%had a certain inhibition impact onBacillus subtilisphages P85 and P90, but not affect the growth ofB.subtilisand spore.

phytic acid;Bacillus subtilis;phages;inhibition

Q939.97

A

0254-5071（2015）06-023-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.027

2015-06-03

国家“863计划”（2003AA241121002）；国家自然科学基金（30200199）

刘秀侠（1988-），女，实验员，硕士，研究方向为芽孢杆菌噬菌体抑制剂及消毒剂的筛选。

*通讯作者：谷巍（1980-），男，高级兽医师，硕士，研究方向为兽医微生物及免疫学。