化学发光酶联免疫法检测苏丹红Ⅰ

（江西科技师范大学生命科学学院，江西 南昌 330013）

化学发光酶联免疫法检测苏丹红Ⅰ

范 艳，孟 玮，朱立鑫，刘仁荣*，许 龙，裘雪梅，杨帆帆

（江西科技师范大学生命科学学院，江西 南昌 330013）

为检测食品中苏丹红Ⅰ残留，建立间接竞争化学发光酶联免疫分析（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）法。通过优化包被抗原中本抗原与载体物质的量比、包被抗原质量浓度、抗体稀释比例，建立竞争抑制曲线。线性范围为0.156～5 ng/mL，最低检测限为0.078 9 ng/mL，IC50为0.679 ng/mL。CLEIA回收率为75.08%～112.18%，变异系数为8.89%～15.61%；通过与酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法进行比较，在相同抗原抗体质量浓度条件下，CLEIA法测定的IC50较ELISA方法降低30%，具有较高的灵敏度。

苏丹红Ⅰ；化学发光酶联免疫分析；酶联免疫吸附分析

苏丹红染料是一系列化学合成的脂溶性偶氮化合物，在工业上广泛应用，如地板、塑料、印刷用油墨等的染色[1]。因为其具有良好的着色性，不法商贩将苏丹红染料作为食品添加剂加入辣椒、番茄等食品中，进入人体内的苏丹红经各种酶系代谢后，形成的部分代谢产物具有致突变、致癌变的生物活性[2-3]。1995年欧盟国家已经禁止将苏丹红作为食用色素，2005年英国食品标准署就食品添加苏丹红色素发出警告[4]，国际癌症研究机构将苏丹红归为三类致癌物。因此需要对食品中含有的苏丹红染料进行监控[5-6]。

现阶段检测苏丹红染料的方法有色谱法、光谱法、免疫检测方法和电化学方法[7-9]等。色谱法主要包括液相色谱-质谱联用[10-12]、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱-二极管阵列检测器和电喷雾电离质谱联用等[13-15]。光谱法有红外光谱快速检测[16]，这些方法具有应用广泛、重复性好和检测结果准确等优点，但需要昂贵的设备、复杂的样品处理过程和较长的检测时间。免疫学检测方法主要有酶联免疫吸附（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法[17-18]、化学发光酶联免疫（chemiluminescentenzyme immunoassay，CLEIA）法[19-22]等。CLEIA法是化学发光法和免疫分析法结合的产物，同时具备化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择性[23]。近年来已经大规模应用到食品有毒有害残留分析。

本实验基于鲁米诺-辣根过氧化物酶系统，对实验因素进行了探索和优化，建立了检测苏丹红Ⅰ（SudanⅠ）的间接竞争CLEIA方法。该方法操作简便、灵敏度高、特异性好，能满足大规模样品的快速筛选。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

SudanⅠ标准品、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG美国Sigma公司；抗SudanⅠ单克隆抗体 本实验室自制；化学发光鲁米诺底物 厦门赫利森公司。

包被液：0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS），pH 7.4；封闭液：50 g/L脱脂奶；清洗液：含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；标准品稀释液：30%甲醇溶液。实验所用化学试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

Luminoskan Ascent化学发光仪、Multiskan MK3酶标仪、Wellwash versa洗板机 美国Thermo公司；96孔酶标板与96孔发光板 美国Costar公司。

1.3方法

1.3.1包被抗原SudanⅠ-BSA的制备

采用活泼酯法进行半抗原与载体蛋白的偶联，称取羧基化SudanⅠ2 mg[24]，N-羟基琥珀酰亚胺2.31 mg，碳二亚胺3.85 mg，溶于400μL N,N-二甲基甲酰胺后，在21℃，120 r/min反应12 h。称取30 mg BSA溶于12 mL 0.13 mol/L NaHCO3溶液中。将活性酯溶液按照不同物质的量比例缓慢滴入BSA溶液中，17℃，120 r/min反应8 h。取出反应液放入透析袋中，在PBS中透析3 d，偶联产物用紫外光谱扫描，根据其在波长280、490 nm处的吸光度A分析测定偶联物的物质的量比。

1.3.2间接竞争CLEIA法的建立

用PBS稀释SudanⅠ-BSA包被在96孔化学发光板，120μL/孔，4℃包被过夜；用PBST洗板4次后，每孔加入320μL脱脂奶在37℃保温保湿2 h。洗板4次后，每孔加入50μL合适质量浓度的抗体稀释液和50μL标准品稀释液，在37℃保温保湿45 min。洗板4次，加入1∶3 000酶标二抗，37℃保温保湿45 min。洗板4次，加入化学发光底物100μL/孔，立即用化学发光检测仪检测各孔化学发光强度。

1.3.2.1最佳包被抗原质量浓度的选择

用方阵滴定法，选取0.5、1、2、4、8μg/mL质量浓度的SudanⅠ-BSA包被96孔板，抗SudanⅠ单克隆抗体按照1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000、1∶1 024 000进行稀释，按照间接CLEIA法步骤，选取最佳包被质量浓度。

1.3.2.2最佳抗体稀释比例的选择

按照选取的最佳SudanⅠ-BSA质量浓度包被96孔板后，选择1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000这4种抗体稀释比例按照间接竞争法，测定对应的化学发光值（relative lighe unit，RLU）和IC50，以IC50和RLUmax/IC50作为评价标准。RLUmax/IC50最大的选为最佳抗体稀释比例。

1.3.2.3间接竞争CLEIA法标准曲线的建立

按照确定的最佳抗原包被质量浓度，最佳抗体稀释比例，以标准品SudanⅠ质量浓度的对数为横坐标，以I/I0（I为不同标准品质量浓度时的RLU；I0为标准品质量浓度为0 ng/mL时的RLU）为纵坐标，通过RIDAWIN免疫分析软件，建立标准曲线。

1.3.3实际样品的加标回收及与ELISA方法的对比

称取辣椒粉1 g放入离心管中，分别添加SudanⅠ标准品0、0.1、0.5、1μg/g。每管加入6 mL乙腈，四管辣椒粉旋涡振荡器剧烈振荡10 min后，超声波提取20 min，然后4 500 r/min离心15min。取上清液3 mL，放入玻璃试管中，用N2吹干，每管加入1 mL甲醇溶解，然后加入蒸馏水配制成30%的甲醇溶液，分别用CLEIA和ELISA方法进行检测（各测4次，取平均值）。

2 结果与分析

2.1 SudanⅠ-BSA人工抗原的制备

通过活泼酯法将SudanⅠ与BSA偶联并透析后得到了人工抗原SudanⅠ-BSA，人工抗原的紫外光谱扫描结果见图1。4条曲线代表4种不同物质的量比例偶联的SudanⅠ-BSA。BSA标准品的特征吸收峰是280 nm，SudanⅠ的特征吸收峰490 nm，人工抗原在波长280 nm与490 nm处均出现了吸收峰，通过绘制SudanⅠ与BSA的标准曲线，计算得出物质的量偶联比例。

图1 4 种偶联比的SudanⅠ-BSA紫外扫描图Fig.1 UV spectra of Sudan Ⅰ-BSA with different conjugation ratios

2.2CLEIA工作条件的确定

2.2.1包被抗原质量浓度的确定

根据方阵滴定结果，在一定的抗体稀释比例下，2μg/mL SudanⅠ-BSA包被时的发光强度明显高于0.5、1μg/mL。4μg/mL与8μg/mL包被时，发光强度变化逐渐平缓，分别将SudanⅠ-BSA用2、4μg/mL和8μg/mL 3种质量浓度进行包被，比较其IC50变化，见图2，在相同的抗体稀释比例下，2μg/mL包被时测定的IC50低于4μg/mL与8μg/mL，综合RLU与IC50选择2μg/mL作为其最优包被质量浓度。

图2 包被质量浓度对CLEIA的影响Fig.2 Effect of coating antigen concentration on CLEIA

2.2.2抗体稀释比例的确定

SudanⅠ-BSA包被质量浓度为2μg/mL时，随着抗体稀释比例的增大，IC50先明显降低，后变化平缓。RLU随抗体稀释比例的增大而显著减小。根据RLUmax/IC50值的变化，在抗体稀释比例为1∶64 000时RLUmax/IC50达到最大，见图3。所以选择抗体最佳稀释比例为1∶64 000。

图3 抗体稀释比例对CCLLEEIIAA的影响Fig.3 Effect of antibody dilution ratio on CLEIA

2.2.3包被抗原SudanⅠ-BSA的半抗原与载体偶联比的影响

图4 SudanⅠ-BSA物质的量比对CLEIA与ELISA的影响Fig.4 Effects of molar ratio of SudanⅠ to BSA on CLEIA and ELISA

SudanⅠ-BSA用4种偶联比例用活泼酯法合成后，按照2.2.1节和2.2.2节的优化过程得到抗原包被质量浓度和抗体稀释比例后，4种不同偶联比的抗原对CLEIA和ELISA两种方法测定的IC50影响见图4。由图4可知，不同的偶联比对CLEIA的IC50影响不大，对ELISA，偶联比在0.27∶1和11.8∶1时，IC50都显著上升，在偶联比值为2.05∶1时，IC50最小，证明SudanⅠ与BSA物质的量比为2.05∶1时，比较合适。所以包被抗原选择偶联比为2.05∶1的SudanⅠ-BSA。

2.2.4CLEIA和ELISA标准曲线的建立

图 55 CCLLEEIIAA间接竞争抑制曲线Fig.5 Indirect competitive inhibition curve of CLEIA

图6 ELISA间接竞争抑制曲线Fig.6 Indirect competitive inhibition curve of ELISA

SudanⅠ-BSA包被质量浓度为2μg/mL，抗体稀释比例为1∶64 000，建立的CLEIA间接竞争曲线见图5。标准品SudanⅠ质量浓度的对数为横坐标，以I/I0为纵坐标。IC50为0.679 ng/mL，线性范围是0.132～5 ng/mL，线性方程为y=-0.45x+0.403 7，R2=0.989 1；选择IC10为最低检测限，最低检测限是0.078 9 ng/mL。建立的ELISA间接竞争曲线见图6，IC50为1.0 ng/mL，线性范围是0.2～5 ng/mL，线性方程为y=-0.443x+0.490，R2=0.998 0；选择IC10为最低检测限，最低检测限为0.118 ng/mL。

2.3样品的检测及与ELISA方法的对比

表11 CCLLEEIIAA加标回收率Table 1 Recovery rates of CLEIA for spiked sample

由表1、2可知，CLEIA法测定的加标回收率为75.08%～112.18%，变异系数为8.89%～15.61%。ELISA法测定的加标回收率为94.59%～150.18%，变异系数为5.3%～10.9%。建立的CLEIA法能检测实际样品。

表2 ELISA加标回收率Table 2 Recovery rates of ELISA for spiked sample

3 结 论

本实验通过优化包被抗原质量浓度、包被抗原偶联比、抗体稀释比例，建立了间接竞争CLEIA法检测辣椒粉中的SudanⅠ的添加量。IC50为0.679 ng/mL，线性范围为0.132～5 ng/mL，最低检测限为0.078 9 ng/mL。包被抗原偶联比对CLEIA方法的IC50影响较小，CLEIA方法的发光强度RLU信号放大倍数优于ELISA方法的吸光度，在相同的低偶联比抗原包被质量浓度条件下，CLEIA方法的IC50较稳定。相同抗原抗体质量浓度条件下，CLEIA法测定的IC50较ELISA方法降低30%左右，相比ELISA方法，CLEIA方法灵敏度较高，检测限低于ELISA方法。测定的辣椒粉中SudanⅠ加标回收率为75.08%～112.18%，变异系数为8.89%～15.61%。与ELISA方法对比，变异系数稍大，是由于化学发光方法很灵敏，操作中的各种因素均会对实验结果造成较大影响，回收率较低，可能是SudanⅠ吸附性较强，在加标回收过程中损失较大。因此实验操作需要快速和准确，相关实验条件也需进一步优化。综合比较两种方法，CLEIA检测方法具有较好的灵敏度和准确度，符合实际样品中苏丹红大批量检测的需求，可用于相关食品安全污染物和非法添加物的快速高效的检测。

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Determination of Sudan Ⅰ by Chemiluminescent Enzyme Immunoassay

FAN Yan, MENG Wei, ZHU Lixin, LIU Renrong*, XU Long, QIU Xuemei, YANG Fanfan
(College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

An indirect competitive chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) was developed for the detection of Sudan Ⅰ in food products. TheCLEIAconditions including molar ratio of coating antigen to carrier, antigen concentration, and dilution ratio of antibody were optimized. In the standard curve of the optimizedCLEIA, the linear range was 0.1 56-5 ng/mL, the half maximal inhibitory concentration (IC50) was 0.679 ng/mL and the limit of detection (LOD) was 0.078 9 ng/mL. TheCLEIAshowed good recoveries with spiked chili powder ranging from 75.08%to 112.18%. Compared with ELISA method, the IC50values ofCLEIAwas reduced by 30%. The proposed method has a high sensitivity.

Sudan Ⅰ; chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA); enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

TQ610.7；O657.3

A

1002-6630（2015）12-0209-04

10.7506/spkx1002-6630-201512039

2014-08-03

江西省自然科学基金项目（20122BAB214006）；江西省教育厅科技项目（GJJ13573）

范艳（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全检测。E-mail：fy12271227@163.com

*通信作者：刘仁荣（1969—），男，教授，博士，研究方向为食品安全检测。E-mail：lilirenrong@hotmail.com