丙戊酸钠对癫痫大鼠海马GFAP表达的影响

高 然 裴雪梅 屠恩远 张文武

广东深圳市宝安区人民医院急诊科 深圳 518101

癫痫（epilepsy）是一组由于脑部神经元异常过度放电所引起的突然、短暂、反复发作的中枢神经系统功能失常的慢性疾病和综合征。近些年研究发现星形胶质细胞（AST）可通过维持神经元内环境，抑制神经递质失衡，减少苔鲜状纤维发芽抑制痫样放电产生，在抗癫痫中发挥越来越重要的作用［1］。丙戊酸钠可治疗数种癫痫发作，其作用强，不良反应小，已被临床广泛应用，但对此药的治疗原理及作用途径尚未完全阐明。本研究通过制备大鼠癫痫模型并予丙戊酸钠作干预，对比AST激活的生化指标星形胶质细胞酸性蛋白（GFAP）变化是否有统计学意义以探讨丙戊酸钠作用途径。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物分组：云南系健康成年雄性SD大鼠40只，体质量（350±20）g，随机分为4组，每组各10只：①正常对照组：未给予任何干预措施。②正常给药组：正常大鼠予丙戊酸钠灌胃。③癫痫模型组：以马桑内脂为致癫剂造癫痫模型，未用丙戊酸钠治疗。④癫痫治疗组：以马桑内脂为致癫剂造癫痫模型，用丙戊酸钠灌胃治疗。

1.1.2 药品试剂、仪器：丙戊酸钠缓释片（德巴金，赛诺菲安万特制药有限公司），GFAP抗体ZA-0117及PV-9000免疫组化检测试剂盒（均为北京中杉金桥生物公司），光学显微镜（Olympus），电动切片机2245型（Laica），Ax07TRF-A荧光显微成像系统（Olympus）拍摄图像。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的制备及取材：每次造模均在上午9时～11时进行。取大鼠称质量后按10μL／g剂量吸取致癲剂马桑内脂，微量注射器将马桑内脂注入大鼠脑室内，观察其活动以Racine做标准：1级：动须、咀嚼；2级：节律性点头；3级：一侧前肢阵挛；4级：站立伴双前肢阵挛；5级：4级＋跌倒伴全身抽搐。达到3级或3级以上为制备成功标准。4组在相同条件（清洁、通风、恒温、恒湿）下饲养7d，正常给药组、癫痫治疗组每天均在同一时间作灌胃（丙戊酸钠100mg／kg）治疗。

1.2.2 固定及取材：作灌注固定，乙醚麻醉大鼠，固定四肢，开胸找到心包膜剪开，穿刺针从心尖部刺入主动脉时用止血钳夹闭，先输生理盐水并剪开右心耳观察流出液体量和澄清度，当流出液体变澄清，肝脏变白时，继输4%多聚甲醛，先快后慢，见大鼠出现肌抖动消失后继续灌注30min。破颅骨后完整的取出脑组织放入4%多聚甲醛中继续浸泡固定，浸泡固定时间为6h温度4℃。

1.2.3 免疫组化：常规脱水、包埋后切片，大鼠大脑行冠状切片，片厚4μm，每5张取1张。以SABC法，脱蜡，灭活内源性酶并行修复抗原，5%BSA封闭滴加已稀释成1：150的一抗（小鼠抗GFAP）4℃过夜，加二抗用DAB显色。苏木素轻度复染，脱水透明封片，显微镜观察。用Olympus光学照像（关闭自动白平衡）海马区域内随机照5张片，用ImagePro-Plus图像分析软件分析，测得每张照片中阳性细胞面积、平均光密度和累积光密度，取各指标的平均值为一例标本的代表值，得4组共200例标本的统计数据均以（±s）表示。

1.3 数据分析 用SPSS 20.0统计分析软件包处理数据。对免疫组化测得的各组数据分别作正态分布检验和方差齐性检验，符合条件后采用单因素方差分析（one-way ANOVA）两两比较。

2 结果

2.1 光镜观察 光镜观察：见已被染成棕色的GFAP阳性蛋白质存在于AST胞浆，并呈现出整个细胞的轮廓及细胞的突触。与正常对照组相比正常给药组几乎无变化，而癫痫模型组变化明显，可见AST肿大，突触增多，呈明显的星形。癫痫治疗组与癫痫模型组相比AST肿大稍减轻，但其突触较明显变长，和正常对照组相比也有明显的差别（见图1～4）。

Image-Pro Plus6.0测得大鼠海马CA1、CA3区GFAP阳性细胞面积、平均光密度和累积光密度。从面积上观察，正常对照组与正常给药组CA1、CA3区差异无统计学意义（P＞0.05），正常对照组与癫痫模型组、癫痫治疗组CA1、CA3区差异均有统计学意义（P＜0.01）。

从各组累积光密也得到相似的结果，正常对照组与正常给药组CA1、CA3区差异均无统计学意义（P＞0.05），正常对照组与癫痫模型组、癫痫治疗组CA1、CA3区差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表1 4组GFAP免疫组化图像分析结果 （±s）

表1 4组GFAP免疫组化图像分析结果 （±s）

注：▲P＜0.01vs生理盐水组、正常组；★P＜0.05vs癫痫模型组

组别 n 细胞面积 累积光密度 平均光密度CA1 CA3 CA1 CA3 CA1 CA3正常对照组 10 307.14±35.50 298.55±42.00 15990.02±2954.68 16184.58±3576.26 0.4121±0.0737 0.4048±0.0639正组给药组 10 302.54±40.80 312.76±33.45 16035.59±2623.83 15637.09±2802.50 0.3794±0.0504 0.3966±0.0655癫痫模型组 10 716.34±57.62▲ 703.61±60.09▲50533.78 ±4574.60▲49701.62 ±4959.65▲0.7066 ±0.1041▲ 0.6779±0.0794▲癫痫治疗组 10 499.75±54.74▲ 508.11±56.96▲31996.24 ±3870.87▲31185.73 ±5343.20▲0.6410 ±0.0908★ 0.6181±0.0881★

平均光密度看，癫痫模型组与正常对照组差异有统计学意义（P＜0.01），与癫痫治疗组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

图1 癫痫模型组GFAP免疫组化阳性细胞（↑）SABC法400×

图2 癫痫模型组GFAP免疫组化阳性细胞（↑）SABC法400×

图3 癫痫模型组GFAP免疫组化阳性细胞（↑）SABC法400×

图4 癫痫模型组GFAP免疫组化阳性细胞（↑）SABC法400×

2.2 图像分析软件结果见表1。

3 讨论

作为治疗成人和儿童全面和部分发作性癫痫最常用的抗癫痫药物之一，丙戊酸钠曾进行多种癫痫发作的动物模型实验，发现其治疗癫痫时所表现的广泛抗癫痫活性以及对其他脑病的疗效不能用某一种药理机制阐述清楚。现多项研究只证实了丙戊酸钠可以促进GABA传导，增强了特定脑区GABA能抑制性神经递质的功能［2-3］。

本研究予丙戊酸钠作为干预因素，对比用药组与非用药组癫痫大鼠海马GFAP表达情况，发现癫痫模型组大鼠AST被激活，细胞肿胀、突触增多、GFAP表达增强；丙戊酸钠治疗组AST肿胀减轻、GFAP表达下降，结果提示丙戊酸钠可减弱已激活的AST。AST正常状态下可对神经元有支持、绝缘、摄取化学物质及以对神经元修复和再生的功能，而激活后的AST却可促进癫痫［4］：（1）激活后形态改变：激活后的AST与神经元之间连接异常、突触囊泡释放增多等变化，是促进癫痫发作的结构基础。（2）激活后分泌功能改变：激活后的AST使IL、TNF-a等细胞因子过度增加，通过电压门控通道提高神经元兴奋性，同时也使神经元线粒体肿胀，细胞蛋白分解过多，神经元坏死，胶质瘢痕形成。（3）激活后的AST使神经递质调节紊乱，增强神经元摄取谷氨酸，兴奋性递质堆积［5］。所以丙戊酸钠可通过减弱已激活的AST而发挥抗癫痫作用。依据其药理推测其影响AST途径是通过改变IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等改变了细胞的活性。同时也有试验证实丙戊酸钠对在抗痉挛作用起效期间，可以改变cGMP水平对抗癫痫。而丙戊酸并不能直接影响cAMP水平，猜测这种影响可能是继发于影响其他细胞的结果［6］，这是否为丙戊酸钠影响AST的结果？可依此试验为基础结合以上种种推断，对比丙戊酸钠干预后AST中IL、TNF-a及cAMP的变化，可进一步阐明丙戊酸钠抗癫痫的机制。

［1］Amiri M，Bahrami F，Janahmadi M.On the role of astrocytes in epilepsy：a functional modeling approach［J］.Neurosci Res，2012，72（2）：172-80.

［2］Morland C，Nordengen K，Gundersen V.Valproate causes reduction of the excitatory amino acid aspartate in nerve terminals［J］.Neurosci Lett，2012，527（2）：100-104.

［3］El HM，Baverel G，Martin G.Effects of valproate on glutamate metabolism in rat brain slices：a（13）C NMR study［J］.Epilepsy Res，2012，99（1-2）：94-100.

［4］Perez EL，Lauritzen F，Wang Y，et al.Evidence for astrocytes as a potential source of the glutamate excess in temporal lobe epilepsy［J］.Neurobiol Dis，2012，47（3）：331-337.

［5］Zhang B，McDaniel SS，Rensing NR，et al.Vigabatrin inhibits seizures and mTOR pathway activation in a mouse model of tuberous sclerosis complex［J］.PLoS One，2013，8（2）：e57 445.

［6］Loscher W.Basic pharmacology of valproate：a review after 35 years of clinical use for the treatment of epilepsy［J］.CNS Drugs，2002，16（10）：669-94.