急性白血病免疫表型及阳性细胞比例分析

莫 扬，李智山

(襄阳市中心医院检验科，湖北 襄阳 441021)

急性白血病(acute leukemia，AL)是由于造血细胞分化阻滞并克隆性增生所致的恶性疾病，免疫分型不仅可以识别白血病细胞的系列来源以及所处的分化阶段，而且可利用某些抗原表达及亚型判断疾病预后。现今流式细胞术(flow cytometry)免疫表型分析已成为AL诊断和分型的重要工具，采用 CD45/侧向角散射(SSC)双参数散点图设门方法可清楚地识别白血病细胞克隆，排除了正常细胞对免疫分型的影响，使得白血病免疫分型结果更为准确、可靠。流式细胞术在白血病免疫分型中用到许多抗体，包括早期非特异性抗体和各系列相关抗体，而各系列相关抗体的敏感性及特异性文献报道不尽一致，尤其是各亚型多种抗原阳性表达患者中阳性细胞的比例报道极少，现将襄阳市中心医院研究结果报告如下。

材料和方法

一、临床资料

选取2007年1月至2010年12月在襄阳市中心医院初诊及外院送检的AL患者共89例，男48例，女41例，平均年龄36.65(3～66)岁。依据法国(French)、美国(American)、英国(British)三国协作组(FAB)制定的分型标准分为:急性淋巴细胞白血病(ALL)29例[急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)26例，急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)3例]，急性髓细胞白血病(AML)60例(M12例、M234例、M38例、M46例、M510例)。

二、方法

1.单克隆抗体选择原则 选用单克隆抗体荧光标记分别为异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)、别藻青蛋白(APC)。依据敏感性与特异性兼顾的原则，确定B-ALL选用CD19-APC(高敏感性)和cCD79a-PE(高特异性);确定T-ALL选用CD7-FITC(高敏感性)和 cCD3-FITC(高特异性);确定 AML选用CD13-PE(高敏感性)和髓过氧化物酶(cMPO)-FITC(高特异性)。其他抗体还有:CD117-PE、CD33-PE、CD11b-APC、CD14-APC、CD64-FITC、CD56-FITC、CD8-FITC、CD4-APC、CD10-FITC、CD34-PE、CD38-APC、CD3-FITC、CD45-PerCP、主要组织相容性抗原(HLA-DR)-PE及同型对照IgG1-FITC/IgG1-PE。以上荧光标记抗体购自美国Becton Dickinson公司。

2.标本采集和流式细胞术分析 取肝素钠抗凝骨髓或外周血2 mL，标本中原始幼稚细胞占全部有核细胞比例≥20%。采用四色直接标记，每管取细胞数1×106/mL。胞膜抗原检测加CD45-PerCP及每种分型单克隆抗体各20 μL，室温暗处孵育15 min，加入溶血剂溶血10 min，加磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后上机分析;胞内抗原检测首先加CD45-PerCP后暗处孵育15 min，加溶血剂溶血10 min，PBS洗涤后加透膜剂暗处孵育10 min，加入胞内抗体室温暗处孵育20 min，加PBS洗涤后上机分析。每测定管获取100000个细胞。测定结果采用cellquestpro软件分析:首先以CD45/SSC设门，圈定CD45弱阳性和SSC较小区域细胞进行分析。然后以其他抗体的二维散点图结合细胞散点分布特点确定白血病细胞在每种抗体的阳性率。胞内抗体以阳性细胞≥10%为阳性，胞膜抗体以阳性细胞≥20%为阳性[1]。本研究采用 FACSCalibur(美国 Becton Dickinson公司)流式细胞仪，测定前以标准校正荧光微球校正仪器;溶血剂及透膜剂均为美国 Becton Dickinson公司产品。

三、统计学方法

结 果

一、AL抗原表达特征

B-ALL主要表达抗原为:cCD79a、CD19、HLA-DR、CD34、CD38、CD13、CD10、CD33;T-ALL主要表达抗原为:cCD3、CD38、CD7、CD34、HLADR、CD4、CD33、CD8;AML 主要表达抗原为:cMPO、CD38、CD13、CD33、CD117、HLA-DR，CD14仅在 M4和 M5b表达;M3主要表达抗原为:cMPO、CD117、CD38、CD13、CD33，低表达 HLADR、CD34。交叉抗原表达:B-ALL主要伴有CD13、CD33表达，T-ALL主要伴有 CD33表达，AML主要伴有 CD7、CD56表达，但 M3除外，见表1。

二、各亚型阳性表达患者的阳性细胞比例

对各亚型(M1由于病例少未纳入分析)抗原阳性表达患者中阳性细胞的比例进行分析，发现其平均阳性细胞比例有区别。胞浆抗体cMPO、cCD79a、cCD3作为系列特异性标志在AML(M5除外)、B-ALL、T-ALL中阳性细胞均有较高的比例，在 50% ～70% 之间;M2中 CD13、CD33、CD34、HLA-DR、CD38阳性表达患者的阳性细胞比例均＞60%，说明这些抗原表达强度高;M3以CD13、CD33阳性细胞比例高，虽有部分患者表达CD34、HLA-DR，但其阳性细胞比例较低，分别仅有31.5%及27.2%，说明抗原为弱表达;M4中以CD38、HLA-DR、CD33阳性细胞比例高，而 CD13仅为42.6%，与M2有较大区别;M5中以CD13、CD33、CD34、HLA-DR 抗原强表达，CD13、CD33表达强度无明显差异，但cMPO阳性细胞比例较低，约在 35%左右;B-ALL中以 CD19、CD10、CD34、CD38强表达，属于交叉抗原表达的CD13明显强于CD33的表达强度;T-ALL中CD7、CD34阳性细胞比例在80% ～90%，3例患者中有2例出现CD33表达且阳性细胞比例高达80%，见表2。

表1 FAB各亚型免疫表型特征

表2 各亚型抗原阳性表达患者中阳性细胞的比例(，%)

表2 各亚型抗原阳性表达患者中阳性细胞的比例(，%)

注:与M2同指标比较，*P＜0.05、＊＊P＜0.01;与CD13比较，#P＜0.01;—为阴性表达或病例数少未纳入统计

抗原M2 M3 M4 M5 B-ALL T-ALL CD7 52.7 ±30.6 — 35.22 ±10.2 — —92.0 ±0.5 CD117 34.8 ±14.7 45.2 ±12.6 20.51 ±4.4 23.3 ±5.9 — —CD38 67.9 ±26.5 48.4 ±20.7 75.9 ±3.8 52.1 ±26.5 72.3 ±19.1 55.9 ±17.9 CD13 73.9 ±21.3 61.6 ±20.3 42.6 ±19.7＊＊ 72.8 ±24.0 71.6 ±27.1 —CD34 75.7 ±21.4 31.5 ±10.2 67.9 ±1.5 70.4 ±7.1 73.7 ±21.5 91.1 ±7.5 HLA-DR 66.7 ±24.6 27.2 ±2.1 79.3 ±8.5 60.3 ±23.6 89.4 ±10.0 59.5 ±52.0 CD33 66.8 ±24.2 70.3 ±25.2 80.7 ±16.3* 87.8 ±21.2 45.7 ±22.6# 83.5 ±16.9#cMPO 54.4 ±11.7 63.0 ±16.2 70.4 ±9.5 34.5 ±10.1* — —CD11b 25.9 ±13.7 32.7 ±9.1 35.8 ±7.6 34.6 ±10.3 24.5 ±1.7 —CD64 28.3 ±14.8 40.5 ±10.2 41.2 ±15.8 78.1 ±23.9＊＊ — —CD14 — — 34.4 ±3.1 57.3 ±45.4 — —CD10 — — — — 66.7 ±15.4 —CD19 — — — — 67.4 ±23.2 —cCD79a — — — — 69.8 ±22.1 —cCD3— —53.6 ±18.9

三、系列分化抗原总表达率及阳性表达患者的阳性细胞比例

将AML各亚型合并统计可知，AML中系列分化抗原总表达率及阳性表达患者的阳性细胞比例为 CD13(96.7%，68.6% ± 22.7%)、CD33(95.0%，72.6% ± 23.5%)、cMPO(90.0%，57.5% ± 26.9%)、CD117(73.3%，33.7% ±14.4%);B-ALL中系列分化抗原总表达率及阳性表达患者的阳性细胞比例为 cCD79a(96.2%，69.8% ± 22.1%)、CD19(96.2%，67.4% ±23.2%)、CD10(53.8%，66.7% ± 15.4%);TALL中系列分化抗原总表达率及阳性表达患者的阳性细胞比例为 cCD3(100.0%，53.6% ±18.9%)、CD7(66.7%，92.0% ±0.5%)。

讨 论

从本研究结果分析发现，胞浆抗原cMPO、cCD79a、cCD3作为系列特异性标志在AML、BALL、T-ALL中总的表达率高达90%以上，且阳性表达患者的阳性细胞比例较高，在50% ～70%之间(M5稍低)，是确定系列必须的抗原。cMPO在AML各亚型中表达率均高，但其阳性表达细胞比例在M5仅有34.5%，明显低于其他AML亚型，在区别M2与M5时可供参考。本研究3例TALL中有1例仅以cCD3阳性表达，依据2001年世界卫生组织(WHO)AL积分系统[2]评分标准，T系积分＞2分而诊断。

AML中 CD13、CD33表达率均 ＞95%，是AML的标志性抗体，但其阳性表达患者的阳性细胞比例有差别，M2中 CD13的阳性细胞比例(73.9%)明显高于M4(42.6%)，而其CD33 的阳性细胞比例(66.8%)低于 M4(80.7%)，差异有统计学意义，说明二者的阳性细胞比例在鉴别M2与M4时有参考价值。国内、外关于 AML中CD117 表达率的报道为 58.2% ～90.38%[3-5]，本研究为73.3%，但其阳性细胞比例只在20% ～45%之间，与李庆等[6]结果相符，显示CD117在AML中为弱表达抗原，但未见在ALL中表达，可作为AML的特异性抗原。CD14只在M4/M5b中表达，对单核系统的特异性很高，其阳性细胞比例分别为 34.4%及 57.3%，与宁铂涛等[7]的研究结果一致。CD64在M5中显示出较高的表达率和阳性细胞比例(60.0%，78.1% ± 23.9%)，从而有助于区别 M2(11.8%，28.3% ±14.8%)，国外文献报道CD64对于M4、M5敏感性和特异性均很高[8];M3 中 CD117、CD13、CD33 均 为100.0%表达，阳性细胞比例分别为 45.2%、61.6% 和70.3%，王亚哲等[9]的文章报道使用PharMingen公司抗体，CD117在M3中阳性细胞比例为71.97%，远远高于本研究结果，可能与抗体种类不同有关。部分M3患者表达CD34、HLADR，但其阳性细胞比例仅有31.5%和27.2%，为弱表达抗原。

B-ALL中CD19及CD10表达率和阳性细胞比例均高，是确定 B系的主要抗原;CD13和CD33是B系交叉表达的主要抗原，表达率相似，但CD13的阳性细胞比例(71.6%)明显强于CD33(45.7%)。3例T-ALL中有2例表达CD7，并且阳性细胞比例高达92.0%，说明CD7是TALL表达重要抗原，而在AML中阳性细胞比例约为30% ～50%，提示当CD7阳性细胞比例明显升高时更应该考虑T-ALL的可能性。这2例患者同时伴有CD33的强表达，阳性细胞比例83.5%，而CD13为阴性表达，与B-ALL有很大的不同。陈丽娟等[10]报道136例T-ALL中31例带有髓系标记，CD13表达高于CD33，与本研究结果不同，可能与我们的病例数太少有关，有待于进一步研究。胞浆cCD3是T-ALL诊断的特异性和敏感性均较高的指标，一般在AML和B-ALL中无表达，本组2例T-ALLCD3阴性而胞浆cCD3检测呈阳性，说明cCD3比CD3敏感性更高。因此，对于伴有其他T系抗原标志而CD3阴性患者，应常规检测cCD3。

CD34为干/祖细胞相关抗原，CD34阳性白血病提示白血病细胞是早期的造血细胞恶化所致，在AML中的阳性率达40% ～60%，和预后有关[11]。本研究显示AML中CD34总的表达率为55.0% ，ALL中 CD34总表达率为65.5%，均与文献报道相符合[12]。除 M3外，CD34阳性细胞比例均显示出较高的水平。另一造血系统早期抗原HLA-DR在M3表达率及阳性细胞水平均较低，在其他类型AL中均为高表达。

综上所述，AL各亚型间抗原表达率及阳性细胞的比例存在差异，可作为流式细胞术免疫分型诊断的依据。

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