UBA3在黑素瘤细胞的表达及其影响黑素瘤细胞生物学行为的研究

程芳 何润之 张磊 张韡 高伟 吕静 孙建方

UBA3在黑素瘤细胞的表达及其影响黑素瘤细胞生物学行为的研究

程芳 何润之 张磊 张韡 高伟 吕静 孙建方

目的探讨UBA3在黑素瘤细胞中的表达，初步观察干扰UBA3对黑素瘤细胞生物学行为的影响。方法用RT-PCR技术观察3株黑素瘤细胞中UBA3的表达，并利用siRNA技术对M14细胞中UBA3的表达进行干扰，检测转染后细胞内UBA3、连接态NEDD8以及p53的表达，并观察转染前后细胞的凋亡及迁移能力的改变。结果在A375、M14及MV3中UBA3的表达均较正常黑素细胞上调，其中M14细胞上调最明显，成功干扰M14中UBA3的表达后，细胞内连接态NEDD8的表达下降，p53的表达明显增加，同时M14细胞凋亡增加、迁移能力下降。结论构建的质粒可干扰UBA3的表达，影响细胞的Nedd化进程，从而影响细胞的生物学行为。

黑色素瘤；泛素；UBA3；细胞凋亡；细胞运动

泛素-蛋白酶体系统(UPS)参与细胞内蛋白降解的精密调节，与细胞周期的有序进行及细胞凋亡有着密切的联系[1]。待降解蛋白被泛素标记的过程称为蛋白的泛素化，泛素化的进行依赖于一系列酶的催化。神经前体细胞表达发育下调蛋白-8(NEDD8)与底物的连接称为类泛素化(Nedd化)，Nedd化的有序进行也需要被一系列酶催化，包括NEDD8激活酶、NEDD8连接酶和NEDD8结合酶。Nedd化与泛素化密切相关，通过一系列调节酶的作用促进泛素化进程[2]。UBA3是NEDD8激活酶的亚基，对于Nedd化的有序进行起着重要的作用，阻断UBA3的表达，将会使Nedd化中断，使蛋白的泛素化无法进行，从而影响肿瘤细胞的生物学行为，影响肿瘤的发展。我们观察UBA3在黑素瘤细胞株中的表达情况，设计并合成针对UBA3的干扰质粒，观察干扰UBA3对Nedd化通路及泛素化通路的影响，初步探讨其对黑素瘤细胞生物学行为的影响。

材料与方法

一、试剂和仪器

DMEM培养基、M254培养基、HMGS、胎牛血清购自德国 Gibco公司。Trizol、G418购自美国Invitrogen公司。RT-PCR试剂盒购自美国Promega公司。Fugen HD试剂盒购自瑞士Roche公司。Hoechst 33258试剂购自南京凯基公司生物科技发展有限公司。抗UBA3抗体、NEDD8抗体、p53抗体及β肌动蛋白抗体购自美国Santa Cruz公司。用于Transwell小室实验的CytoSelect 24孔细胞移行实验试剂盒购自美国Cell Biolabs公司。9700型GeneAmpPCR仪购自美国应用生物系统公司。

二、细胞培养

黑素瘤细胞系A375由第四军医大学西京医院馈赠，M14、MV3购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，培养基为含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，培养条件37℃，5%CO2。从健康男性包皮提取培养黑素细胞，将提取的原代细胞移至M254培养基(添加HMGS)进行培养传代，经S100免疫组化染色证实纯度超过95%，实验所用细胞均收于对数生长期。

三、实验方法

1.引物设计：基因库上查找UBA3的基因全序列，GeneID：9039，用Primer Premier 5.0软件设计，并使用核算序列数据库检索程序排除其他的可能同源序列。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为5'-GATGTTGCAGT GGCCTAAGGAG-3'；3'-GTGGCTGTGATGGCTGGA GATT-5'。

2.shRNA序列设计：用美国Ambion公司和德国Qiagen公司的siRNA设计软件，设计siRNA序列3条，由南京金斯特公司合成双链shRNA编码序列。

3.RT-PCR检测A375、M14及MV3中NEDD8相关蛋白的表达：对象为恶性黑素瘤细胞系A375、M14、MV3，以正常原代培养黑素细胞为对照。首先用Trizol提取各株细胞的总RNA，经分光光度计检测A260/A280比值在1.9～2.1之间，各样本分别取总RNA 1 μg，用Oligo(dT)引物，按说明书推荐条件将其反转为cDNA。扩增目的片段反应条件为：95℃2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环 30 次；72℃10 min。15 g/L琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像仪下拍照。所有试验重复3次。以UBA3的灰度值/β肌动蛋白灰度值表示目的基因的表达水平，采集3次实验数据，计算目的基因表达水平的95%可信区间。

4.细胞株的培养及转染：M14细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，培养条件37℃，5%CO2。选择对数生长期的细胞接种于24孔板，按照Fugen HD转染试剂说明书进行转染。初步筛选出的最佳转染条件为：转染的混合物比例为3∶2，转染混合物的孵育时间为20 min，转染后孵育48 h将其从24孔板上消化，接种入培养瓶。1 000 μg/ml的G418浓度为最终确定的筛选浓度，维持该浓度2周进行筛选。将筛选的细胞消化后，以较稀疏的密度重新接种。待接种的细胞形成克隆，且克隆间尚未发生融合时，在荧光显微镜下，用刮刀挑取阳性克隆，继续培养于含G418 500 μg/ml的培养基中。

5.shRNA的选择：带有双链shRNA的3组质粒，以及空质粒shRNAT-U6.2转染M14细胞后，以Western印迹法检测转染后细胞内UBA3及连接态NEDD8的改变，选出具有最佳干扰效果的质粒。

6.Western印迹实验：取对数生长期的细胞，PBS洗涤细胞后，加入预冷的蛋白裂解液200 μl，冰上充分裂解40 min，高速离心后收集上清，考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度。取70 μg蛋白上样，经10%SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，加入一抗：抗UBA3抗体、NEDD8抗体及p53抗体，β肌动蛋白为内参照，氧化物酶标记的鼠抗为二抗，TBST洗膜后加入ECL化学发光液，X线片暗室曝光、显影及定影，Band-Scan 4.5软件分析蛋白条带。

7.Hoechst 33258细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变：将转染前后的M14细胞以1×104的浓度分别接种于24孔板，待细胞贴壁生长后，吸去培养液，用PBS清洗2次，加入40 g/L的多聚甲醛液固定10 min，吸去固定液，PBS清洗1次，加入5 mg/L的 Hoechst 33258，染色 10 min，用PBS清洗3次，自然干燥，荧光显微镜下观察细胞凋亡形态，实验重复3次。

8.Transwell实验：分别取对数生长期的未转染M14细胞空白质粒转染M14细胞以及shRNAUBA3转染M14细胞，以胰蛋白酶消化计数后，以无血清培养基调整浓度为0.6×106/ml。将Transwell小室置入24孔板中，在小室中加入300 μl无血清培养基，室温放置2 h，在小室外部加入含10%血清的培养基500 μl后，弃去小室内部的无血清培养基，加入300 μl细胞悬液，孵育48 h。弃去小室内的上清并轻拭去小室内膜多聚碳酸酯膜上的细胞，小室置入含有500 μl染液的培养孔中染色20 min，以清水去除多余的染液，干燥后显微镜下计数穿过小室的细胞数，每组实验重复3次。

9.统计学方法：用SPSS 13.0软件处理数据，用t检验分析RT-PCR以及细胞迁移实验数据，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 M14细胞转染前后 稳定转染后，表达GFP荧光蛋白的细胞达到95%以上，转染空质粒或转染带有shRNA片段的质粒对细胞的形态几乎无影响 1a：转染前M14细胞组(×200)；1b：shRNAT-U6.2转染组(× 400)；1c：shRNA-UBA3转染组(× 200)；1b、1d激发荧光前；1c、1e激发荧光后

结 果

一、黑素瘤细胞株中UBA3的表达

UBA3在正常黑素细胞株中表达极低，但是在黑素瘤细胞株A375、M14和MV3中的表达均较正常黑素细胞中的表达明显升高(P＜0.05)，其中在M14中的表达最高，因此我们选择M14进行进一步实验。

二、转染前后M14细胞内UBA3表达的变化

经过G418筛选及单克隆挑选后，表达GFP荧光蛋白的细胞达到95%以上，转染空质粒或转染带有shRNA片段的质粒对细胞的形态几乎无影响(图1)。用Western印迹检测干扰前后细胞内UBA3的蛋白表达量，选出一条最优shRNA，序列为5'-GGATCCCGTGCACGCTGGAACTTTATCTTCAAGAG AGATAAAGTTCCAGCGTGCATTTTTTCCAACTCGA G-3'，其干扰效果如图2所示，干扰后M14细胞中的UBA3明显降低，干扰效果显著。

图2 转染前后细胞中UBA3的表达 与未转染组和空白转染组相比，转染组中UBA3的表达明显下降。1：未转染组M14(0.3845)；2：空白质粒转染组shRNAT-U6.2(0.5314)；3：转染组shRNA-UBA3(0.0206)

三、转染前后M14细胞内连接态NEDD8表达的变化

UBA3是NEDD8激活酶的亚基，是NEDD8被激活的第一步，干扰UBA3的表达将会使NEDD8与底物的连接受到影响，连接态NEDD8表达明显下调，连接态NEDD8在蛋白电泳图上表现为一系列条带，其中最具有代表性的为95 000，其他相对分子质量的电泳条带在不同种类的标本中表现不同[3]。在实验中干扰UBA3的表达后，伴随UBA3的下调，连接态NEDD8的表达也明显下降，如图3所示。说明成功干扰UBA3的表达后细胞内连接态NEDD8的形成将会受到影响。

图3 转染前后细胞中连接态NEDD8的表达 与未转染组和空白转染组相比，实验组中连接态NEDD8(95 000)的表达明显下降。1：未转染组M14(0.8851)；2：空白质粒转染组shRNAT-U6.2(0.9471)； 3：转染组shRNA-UBA3(0.1037)

四、转染前后M14细胞内p53表达的变化

p53是通过泛素蛋白酶体系统来进行降解的[4]，成功干扰UBA3的表达造成Nedd化通路的进行受阻后，p53的泛素化也将会受到影响，从而影响其降解，使其在细胞内聚集。实验中，伴随UBA3表达的下降，不仅连接态NEDD8的表达下调，p53的表达也明显上升，如图4所示。证实通过干扰UBA3的表达成功影响Nedd化的进程后，p53的泛素化减少，降解减少。

五、转染前后细胞凋亡的形态学变化

如图5所示，Hoechst33258细胞核染色结果显示，转染后部分细胞出现核固缩、染色质凝集以及核碎裂的细胞凋亡特征，未转染组以及空白转染组细胞核呈椭圆形，染色质分布均匀，几乎未见凋亡细胞。此结果表明干扰UBA3的表达将会使细胞凋亡增加。

图4 转染前后细胞中p53的表达，与未转染组和空白转染组相比，实验组中p53的表达明显增加。1：未转染组M14(0.3995)；2：空白质粒转染组shRNAT-U6.2(0.4057)；3：转染组shRNA-UBA3(1.1583)

图5 转染前后细胞凋亡的形态学变化 转染后部分细胞出现核固缩、染色质凝集以及核碎裂(箭头)，未转染组以及空白转染组细胞核呈椭圆形，染色质分布均匀 5a：未转染的M14细胞组；5b：shRNAT-U6.2组；5c：shRNA-UBA3组 图6 M14细胞穿过人工基底膜 穿过多聚碳酸酯膜的细胞被染液染成紫色，与两个对照组相比，实验组穿膜细胞数明显减少 6a：未转染的M14细胞组；6b：shRNAT-U6.2组；6c：shRNA-UBA3 组

六、Transwell小室

小室的人工基底膜使细胞无法自由通过，只有具有迁移能力的细胞分泌水解酶破坏人工基底膜，再经过细胞的变形通过微孔才能到达聚碳酸酯膜下表面。计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，可以用来研究细胞的迁移能力。如图6所示，实验组穿过人工基底膜的细胞数较未转染组和转染阴性质粒组明显降低。未转组M14细胞的平均穿膜细胞数为(82.67±13.65)个/视野，M14/shRNAT-U6.2组平均穿膜细胞数为(69.33±22.28)个/视野，M14/shRNAUBA3组的平均穿膜细胞数为(18±8.54)个/视野，实验组与两个对照组的差异有统计学意义(P＜0.05)。结果表明干扰UBA3的表达，将会使M14细胞的迁移能力明显下降。

讨 论

NEDD8是一种类泛素蛋白，由81个氨基酸组成，与泛素有60%相同序列，有80%的同源性[5]。NEDD8对底物的修饰称为Nedd化，Nedd化参与调解泛素化的进程，与泛素化的关系密切相关。近来新发现的小分子化合物MLN4924是一种NEDD8激活酶的阻断剂，在一期临床阶段表现出了良好的促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤转移的作用[6]。这在一定程度上说明了NEDD8通路和肿瘤的密切关系。已证实NEDD8通路的上调与多种肿瘤相关。乳腺癌相关蛋白3(BCA3)是NEDD8修饰的底物之一，NEDD8可以对BCA3的第11个赖氨酸残基进行修饰，修饰后的BCA3可以作为NFkB的共抑制者，抑制肿瘤坏死因子诱导的NFkB激活，抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的发生[7]。另外研究者对口腔鳞癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌等多种恶性增殖细胞株进行了细胞Nedd化的检测，研究发现在这些恶性细胞株中连接态NEDD8均有升高，且强度与细胞的增殖能力呈正相关[8]。我们的研究中发现黑素瘤中Nedd化也出现了上调[3]，因此希望通过对该通路进行阻断，发现黑素瘤新的治疗途径。

UBA3是NEDD8特异性激活酶E1(APP-BP1/UBA3二聚体)的重要组成部分，是NEDD8激活的第一步，NEDD8羧基末端的甘氨酸残基在这一过程中与UBA3的半胱氨酸结合形成高能硫酯键；第二步NEDD8由E1传递到NEDD8特异性的连接酶E2，即UBC12，与UBC12的半胱氨酸形成硫酯键。最后在结合酶E3的帮助下激活的NEDD8以其羧基末端的甘氨酸与底物连接[9]，如Cullins蛋白，当Cullins蛋白发生Nedd化后，其空间构像发生改变，可以促进泛素链向底物转移，促进底物的泛素化[10]，从而使p53、p21、cyclin D、bax等通过泛素途径降解的细胞周期或凋亡调节蛋白降解加速。

利用RNAi技术阻断UBA3的表达可以抑制Nedd化的进行，从而影响细胞周期蛋白及凋亡因子等的泛素化及其降解过程，影响肿瘤的生物学行为。在本实验中，我们首先利用RT-PCR技术观察3株黑素瘤细胞株中UBA3的表达上调，其中M14细胞株中UBA3的表达上调最明显，故选择该细胞株进行后续试验。利用RNAi干扰技术下调了UBA3的表达，实验观察到伴随UBA3的表达下降，连接态NEDD8的表达也明显下调，证实了UBA3作为NEDD8激活酶的重要亚基对整个Nedd化通路的影响，Nedd化通路的顺利进行是泛素-蛋白体系统有序运行的保证，伴随连接态NEDD8的下调，蛋白的泛素化也将受到影响。p53是由泛素-蛋白酶体系统来进行降解的蛋白，干扰UBA3后，p53表达的上调证实了蛋白的泛素化受到干扰，降解减少，同时也明确了我们构建的质粒对UBA3表达的干扰效果。

p53的表达与肿瘤细胞的凋亡密切相关，实验中我们进一步观察了干扰后细胞的凋亡情况，经过Hoechst33258细胞核染色后，转染组部分细胞出现明显的核固缩、染色质凝集以及核碎裂，这些均为细胞凋亡的典型表现，而未转染组以及空白转染组细胞核呈椭圆形，染色质分布均匀，几乎未见凋亡细胞。本实验不仅证实干扰UBA3的表达后，细胞凋亡增加，也说明我们选择的空白质粒对细胞的的影响很小，适于后续研究。

Transwell小室实验主要用来观察细胞的迁移能力，小室的的底部为一张具有通透性的多孔聚碳酸酯滤膜，类似基底膜的结构，使细胞不能自由通过，具有迁移能力的细胞分泌水解酶破坏人工基底膜后，再经过细胞的变形才能通过微孔到达聚碳酸酯膜下表面。计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，可以用来判断细胞的迁移能力如何。本实验中，实验组到达聚碳酸酯膜下表面的细胞数较两个对照组均明显下降，反映了干扰UBA3可以对细胞迁移能力产生影响。本实验通过RT-PCR技术观察到黑素瘤细胞株中UBA3上调明显，利用RNAi技术对M14细胞株中UBA3的表达进行了干扰，观察到转染后M14细胞凋亡增加，迁移能力下降，深入的作用机制尚需进一步研究。

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2013-08-30)

(本文编辑：吴晓初)

Expression of ubiquitin-like modifier activating enzyme 3 in melanoma cells and its effect on the biological behavior of melanoma cells

Cheng Fang*，He Runzhi，Zhang Lei，Zhang Wei，Gao Wei，Lyu Jing，Sun Jianfang.*Xingtai People's Hospital，Xingtai 054001，Hebei，China

Sun Jianfang，Email:fangmin5758@aliyun.com

ObjectiveTo detect the expression of ubiquitin-like modifier activating enzyme 3(UBA3)in melanoma cells，and to estimate the effect of RNA interference in UBA3 expression on the biological behavior of melanoma cells.MethodsReverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)was performed to detect the expression of UBA3 in three melanoma cell lines(A375，M14 and MV3)and normal melanocytes from healthy human foreskin.Three short hairpin RNAs(shRNAs)targeting the UBA3 gene were designed and synthesized.To select the most efficient shRNA，some M14 cells were transfected with constructed plasmids containing the three shRNAs separately and an empty plasmid respectively followed by the determination of UBA3 and NEDD8(neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated 8)expression by Western blot.Then，some M14 cells were divided into two groups to be transfected with the selected shRNA-containing plasmid(shRNA-UBA3)and an empty plasmid respectively，with untransfected cells serving as the control.Subsequently，the expression of p53 was measured by Western blot，cell apoptosis detected by Hoechest 33258 nuclear staining，and migration activity evaluated by Transwell assay.ResultsThe expression of UBA3 was significantly up-regulated in all the three melanoma cell lines，especially in M14 cells，compared with the normal melanocytes.In comparison with the M14 cells remaining untransfected and transfected with the empty plasmid，those transfected with shRNA-UBA3 showed an obvious decrease in the expression of NEDD8 ligated to proteins and migratory activity(allP＜0.05)，but an increase in p53 expression and cell apoptosis.ConclusionsThe shRNA-UBA3 eukaryotic expression plasmid constructed in this study could efficiently interfere in the expression of UBA3，affect the neddylation process，and influence the biological behavior of M14 cells.

Melanoma；Ubiquitin；Ubiquitin-like modifier activating enzyme 3；Apoptosis；Cell movement

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.004

国家自然科学基金(81272992)；江苏省自然科学基金(BK20131063)；河北省邢台市科技计划项目(2012ZC184)

054001河北省邢台市人民医院(程芳、何润之、高伟、吕静)；江西省皮肤病医院(张磊)；中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所(张韡、孙建方)

孙建方，Email：fangmin5758@aliyun.com