全淋巴区电子线照射治疗MRL/lpr狼疮小鼠疗效观察与机制探讨

丁文 于湛 宋智琦

全淋巴区电子线照射治疗MRL/lpr狼疮小鼠疗效观察与机制探讨

丁文 于湛 宋智琦

目的观察全淋巴区电子线照射治疗MRL/lpr狼疮小鼠的疗效，并探讨其与调节性T细胞的关系。方法将18只4月龄的MRL/lpr小鼠随机分为阴性对照组、放射治疗组、地塞米松治疗组，每组6只，雌雄各半，阴性对照组予生理氯化钠溶液0.5 ml腹腔注射每日1次，连续2周；放射治疗组全身淋巴结予电子线照射，2 Gy/d，每周5次，连续2周；地塞米松治疗组予地塞米松1 mg/kg腹腔注射每日1次，连续2周，实验结束后2周测各项指标。考马斯亮蓝法测24 h尿蛋白，ELISA法检测各组小鼠ANA及抗dsDNA抗体水平，直接免疫荧光法观察各组小鼠IgG抗体在肾脏的沉积情况，PAS染色法观察各组小鼠的肾脏情况，流式细胞仪测定各组小鼠脾脏细胞中调节性T细胞所占比例。用SPSS11.5统计软件进行多样本组间单因素方差。结果放射治疗组小鼠24 h尿蛋白含量为(3.33±0.17)mg，阴性对照组为(3.97±0.33)mg，两组比较，P＜0.05。放射治疗组小鼠血清抗核抗体ANA水平为(275.12±30.18)U/ml，抗小鼠dsDNA抗体为(455.74±43.38)IU/ml；阴性对照组小鼠分别为(434.82±36.63)U/ml和(956.78±37.69)IU/ml，两组比较，均为P＜0.05。放射治疗组与地塞米松治疗组小鼠肾小球内IgG沉积较阴性对照组减少，强度较弱，放射治疗组、地塞米松治疗组两组无明显差异。PAS染色可见放射治疗组与地塞米松治疗组肾脏病变较阴性对照组减轻，放射治疗组、地塞米松治疗组两组无明显差异。流式细胞仪检测显示，放射治疗组小鼠调节性T细胞所占比例为(1.08±0.52)%，地塞米松治疗组为(1.18±0.60)%，阴性对照组为(0.38±0.14)%，放射治疗组、地塞米松治疗组两组的调节性T细胞所占比例较阴性对照组升高(P＜0.05)。结论全淋巴区电子线照射能降低MRL/lpr狼疮小鼠尿蛋白、血清抗核抗体、双链DNA抗体水平，对肾脏病理改变亦有恢复作用，其机制可能与提高体内调节性T细胞的比例有关。

小鼠，近交MRL lpr；红斑狼疮，系统性；T淋巴细胞，调节性；淋巴照射

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一类以多种自身抗体产生及继发免疫复合物沉着为特点的自身免疫性疾病。糖皮质激素和免疫抑制剂是目前主要的治疗药物，但长时间应用可出现严重不良反应[1]。斯坦福大学医学中心应用千伏X线全淋巴区照射技术(total lymphoid irradiation，TLI)治疗难治性狼疮患者，取得了较好的临床疗效[2]。但千伏X线照射皮肤剂量高，剂量跌落慢，照射靶目标后方的正常组织受照剂量高[3]。MRL/lpr小鼠为SLE模型小鼠，可出现抗dsDNA抗体、高滴度的ANA抗体、轻中度的蛋白尿，肾脏可出现免疫复合物肾小球肾炎[4]等。SLE的发病与T淋巴细胞过度活化及功能异常导致多克隆B细胞活化密切相关，而调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类具有免疫抑制功能的细胞。CD4+CD25+Treg即目前主要的Treg细胞群[5]。目前认为，Foxp3可作为Treg细胞群的特异性标记物[6]。近年有报道[5]，Treg细胞群对放射线具有较好的耐受性。本研究采用电子线施全淋巴区照射技术治疗MRL/lpr狼疮小鼠，探讨全淋巴区照射治疗SLE的作用及其机制。

材料与方法

一、动物与材料

1.MRL/lpr小鼠：体重(32±2.5)g，16周龄，雌雄各9只，购自南京大学模式动物研究所；SPF级，合格证编号：SCXK(苏)2010-0001。动物在25～27℃、45%～50%湿度的半屏障系统环境下饲养。所有小鼠均自由摄食摄水，普通饲料饲养。

2.主要试剂与设备：异硫氰荧光素(FITC)抗小鼠 CD4、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)抗小鼠 CD25、PE抗小鼠 Foxp3(美国Biolegend公司)；FITC标记山羊抗小鼠IgG(美国Southern Biotech公司)；地塞米松磷酸钠注射液(天津金耀集团有限公司)；小鼠红细胞裂解液(美国BD公司)；生理氯化钠溶液(青岛华仁药业股份有限公司)；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成科技有限公司)；小鼠抗核抗体(ANA)试剂盒及抗小鼠dsDNA抗体试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)；Varian Clinac 23EX医用直线加速器(美国Varian公司)；FACS Vantage流式细胞仪(美国BD公司)。

二、动物分组与处理

将18只MRL/lpr小鼠随机分为3组，每组6只，3雄3雌。阴性对照组：予生理氯化钠溶液腹腔注射，每日1次，每次0.5 ml，连续2周；放射治疗组：将大部分颅骨、肋骨、肺、后足及尾部用铅板遮盖起来后，露出全身主要淋巴组织，予VARIAN CLINAC 23EX医用直线加速器用6 MeV电子线照射下颌骨、颈部、腋窝、腹股沟和肠系膜淋巴结区以及胸腺、脾脏，每次2 Gy，每周5次，连续2周(图1)；地塞米松治疗组，予地塞米松1 mg/kg腹腔注射，每日1次，连续2周；实验结束后2周检测3组小鼠的各项指标。

三、小鼠24 h尿蛋白检测

代谢笼法收集各组小鼠24 h尿液后，按照考马斯亮蓝试剂盒说明书检测24 h尿蛋白含量。

四、小鼠血清ANA及抗dsDNA水平检测

摘取眼球法取小鼠外周血，300×g离心10 min，收集上层血清检测。按照ELISA试剂盒说明书测定小鼠血清ANA及抗小鼠dsDNA抗体的含量。

五、调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3)在CD4+细胞群中所占比例检测

断颈处死小鼠，取脾脏组织制备脾细胞悬液后，加入红细胞裂解液，计数重悬，使100 μl悬液中含106个细胞。加入FITC标记的抗鼠CD4抗体2 μl，PerCP标记的抗鼠CD25抗体2 μl。4℃避光20 min后，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，加入新鲜配制的破膜液1 ml，4℃保存。4 h后用破膜缓冲液洗涤后，加入高亲和力抗鼠CD16/32封闭Fc段15 min。加入藻红蛋白(PE)标记的Foxp3单克隆抗体 2 μl，4℃避光30 min后流式细胞仪检测各组小鼠的CD4+CD25+Foxp3占CD4+细胞群的百分比。

六、小鼠肾脏肾小球IgG免疫复合物沉积检测

小鼠断颈处死后，取一侧肾脏组织制作成冰冻切片。直接免疫荧光法观察小鼠肾脏肾小球IgG免疫复合物的沉积情况：滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG，将切片置于湿盒内，37℃孵育45 min，室温2 h。用pH 7.4的0.01 mol/L PBS洗片3次，每次3 min(置摇床)。于4℃冰箱避光放置。荧光显微镜下观察肾小球IgG免疫复合物的沉积情况。

七、小鼠肾脏病理变化检测

取另一侧小鼠肾脏组织进行高碘酸雪夫染色(PAS)，观察各组小鼠肾脏病理变化情况。

八、统计学处理

结 果

一、全淋巴区电子线照射治疗MRL/lpr狼疮小鼠后各项检测结果

照射治疗MRL/lpr狼疮小鼠后各项检测指标变化见表1。可见电子线放射治疗能降低MRL/lpr狼疮小鼠尿蛋白含量，减少小鼠血清中ANA及抗dsDNA抗体水平，提高小鼠脾脏Treg占CD4+细胞群的比例。以上各指标经方差分析，3个组差异均有统计学意义。

二、小鼠肾脏肾小球IgG免疫复合物沉积结果

荧光显微镜下观察，放射组与地塞米松组较阴性对照组小鼠肾小球内IgG免疫复合物沉积减少，强度减弱(图2)。

三、小鼠肾脏病理变化

PAS染色观察各组小鼠肾脏情况示(图3)，阴性对照组小鼠肾脏系膜细胞及系膜基质弥漫性重度增生，并可见小新月体形成，肾小球内皮下和上皮下可见大量嗜伊红物质沉积。放射组及地塞米松组小鼠肾脏病变程度较阴性对照组减轻，系膜细胞及系膜基质轻中度增生，未见新月体，肾小球内皮下和上皮下嗜伊红物质沉积减少。

表1 全淋巴区电子线照射治疗MRL/lpr狼疮小鼠后各项检测指标变化(±s)

表1 全淋巴区电子线照射治疗MRL/lpr狼疮小鼠后各项检测指标变化(±s)

注：a：小鼠脾脏调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3)在CD4+细胞群中所占比例

组别 只数 24 h尿蛋白(mg)调节性T细胞a(%)阴性对照组 6 3.97±0.33 434.82±36.63 956.78±37.69 0.38±0.14放射治疗组 6 3.33±0.17 275.12±30.18 455.74±43.38 1.08±0.52地塞米松治疗组 6 3.32±0.23 284.79±18.20 475.40±34.86 1.18±0.60 F值 13.41 55.86 320.82 5.26 P值＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05血清ANA含量(U/ml)血清dsDNA抗体含量(IU/ml)

图1 医用直线加速器电子线照射MRL/lpr小鼠全身淋巴结 1a：遮盖小鼠的铅板，遮盖大部分颅骨、肋骨、肺脏、后足及尾部，中间镂空处露出全身主要淋巴组织；1b：予6 MeV电子线照射全身主要淋巴结下颌骨、颈部、腋窝、腹股沟和肠系膜淋巴结及胸腺、脾脏

图2 直接免疫荧光法观察各组MRL/lpr小鼠肾小球IgG免疫复合物沉积情况(×100) 2a：阴性对照组；2b：放射组；2c：阳性对照组。放射组与阳性对照组较阴性对照组小鼠肾小球内毛细血管襻的荧光强度减弱，IgG免疫复合物沉积减少

讨 论

Treg是一种功能成熟的T细胞亚群，具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特点。Treg在T细胞群中对放射又具有较高的耐受性[5]，故放射治疗后Treg所占的比例升高。而调节性T细胞比例的增高，可以使机体在放射治疗后的免疫功能重建中，对自身抗原重新产生耐受，异常的免疫反应减弱，自身抗体减少，从而达到新的免疫平衡，最终达到治疗疾病的目的。在本研究中，放射治疗后狼疮小鼠的各项指标明显好转，且Treg所占比例升高，因此，我们认为该治疗作用的机制可能为通过电子线全淋巴区照射，使大部分免疫细胞群发生凋亡，而Treg对放射线不敏感，数量下降不明显，因此数量相对增高。Treg的相对数量增加，可使机体在放射治疗后的免疫功能重建中，对自身抗原重新产生耐受，异常的免疫反应减弱，从而达到了新的免疫平衡。本研究中，地塞米松组的Treg比例亦增高。验证了糖皮质激素类药物可调节Treg的比例治疗红斑狼疮。

图3 各组MRL/lpr小鼠肾脏PAS染色(×400) 3a：阴性对照组；可见系膜细胞及内皮细胞明显增殖，基底膜明显增厚；3b：放射组；基底膜增厚较阴性对照组略为减轻；3c：阳性对照组；细胞增殖及基底膜增厚较阴性对照组明显减轻

Matsumoto等[7]发现，携带lpr基因的小鼠里Fas基因抗原基因和胸腺内自身反应性T细胞负选择存在着缺陷，因为MRL/lpr小鼠体内lpr基因的突变，不能产生功能性Fas抗原，从而使自身反应性T细胞逃避胸腺负选择而大量释放进入外周器官，造成自身免疫疾病的发生[8]。MRL/lpr小鼠的寿命多为5～7个月，死因通常为免疫性肾小球肾炎[9]。可有肾小球内皮细胞和系膜增生，偶可有新月体生成，间质内可有明显的单核细胞浸润[10-11]。本研究发现，放射组治疗后，小鼠肾脏病变程度较阴性对照组减轻，系膜细胞及系膜基质增生减轻。同时研究发现，放射组与阴性对照组比较，尿蛋白含量明显下降，因此，全淋巴区电子线照射治疗对于小鼠肾脏病理改变的恢复具有较好的疗效。

全淋巴区照射技术的优点是精确度较高，摆位简单，计量均匀，可以保护正常组织特别是肺脏免受照射，从而避免间质性肺炎的发生，减轻全身不良反应。以往利用的是千伏X线全淋巴区照射，千伏X线的皮肤剂量高，剂量跌落慢，照射靶目标后方的正常组织受照射剂量高。而本研究采用电子线，可以更好地保护正常组织[3]，弥补了以往千伏X线的不足。目前，全淋巴区电子线照射治疗的长期预后仍不确定，主要担心其会增加罹患各种肿瘤的风险。Samuel等[12]对接受全淋巴区电子线放射治疗的SLE患者进行了长达12～79个月的随访，观察发现，治疗3个月后，患者的血清学指标及肾脏病变指标均有显著改善，并且效果可持续3年之久。虽治疗后患者的T辅助淋巴细胞有明显下降，但随后可恢复，且不孕不育、感染及恶性血液肿瘤风险均比接受烷化剂药物治疗者低。

本研究的小鼠照射野[13]主要为下颌骨淋巴结、颈部淋巴结、腋窝淋巴结、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、胸腺和脾脏这些全身主要淋巴结，而将小鼠的大部分颅骨、肋骨、肺脏、后足及尾部用铅板遮盖，减少了全身不良反应。但本实验只研究了14 d内全淋巴区照射治疗MRL/lpr狼疮小鼠的疗效，未发现全淋巴区照射治疗的不良反应，今后有必要进行长期治疗的疗效及其不良反应观察。

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2013-04-01)

(本文编辑：颜艳)

Therapeutic efficacy and mechanism of total lymphoid irradiation with electron beam in MRL/lpr mouse model of lupus

Ding Wen，Yu Zhan，Song Zhiqi.First Affiliated Hospital，Dalian Medical University，Dalian 116011，China

s:Song Zhiqi，Email:szqdalian@yahoo.com；Yu Zhan，Email:yuzhan@yahoo.com

ObjectiveTo evaluate the therapeutic efficacy of total lymphoid irradiation with electronic beam in MRL/lpr mouse model of lupus，and to assess the relationship between total lymphoid irradiation and regulatory T(Treg)cells.MethodsEighteen four-month-old MRL/lpr lupus mice were randomly divided into three groups with three female mice and three male mice in each group:negative control group treated with intraperitoneal sodium chloride physiological solution 0.5 ml once daily，radiotherapy group receiving total lymphoid irradiation with the electronic beam(2 Gy per day)five times a week，and dexamethasone group treated with intraperitoneal dexamethasone 1 mg/kg once daily for two consecutive weeks.Then，Coomassie brilliant blue method was used to quantify the 24-hour urinary protein，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to measure the serum levels of antinuclear antibody(ANA)and anti-dsDNA antibody.All the mice were sacrificed，renal tissue was obtained and subjected to direct immunofluorescence assay for the observation of IgG deposits as well as periodic acid-Schiff staining for the evaluation of renal injury，and spleen tissue was isolated and subjected to flow cytometry for the determination of proportion of Treg cells in spleen cells.Data were processed using the SPSS 11.5 software.Statistical analysis was done with one-way analysis of variance.ResultsSignificant differences were observed between the radiotherapy group and negative control group in 24-hour urinary protein level((3.33±0.17)vs.(3.97±0.33)mg，P＜0.05)，serum ANA antibody level((275.12±30.18)vs.(434.82±36.63)U/ml，P＜0.05)and anti-dsDNA antibody level((455.74±43.38)vs.(956.78±37.69)IU/ml，P＜0.05).The glomerular deposition of IgG antibody was obviously decreased with attenuated renal injury in the radiotherapy group and dexamethasone group compared with the negative control group，but no significant difference was noted between the radiotherapy group and dexamethasone group.The proportion of Treg cells in the radiotherapy group and dexamethasone group was significantly higher than that in the negative control group((1.08±0.52)%and(1.18±0.60)%vs.(0.38±0.14)%，bothP＜0.05).ConclusionsTotal lymphoid irradiation with electronic beam can effectively reduce urine protein level，serum ANA and anti-dsDNA antibody level in MRL/lpr lupus mice，alleviate renal injury，likely by up-regulating the proportion of Treg cellsin vivo.

Mice，inbred MRL lpr；Lupus erythematosus，systemic；T-lymphocytes，regulatory；Lymphatic irradiation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.005

116011大连医科大学附属第一医院

宋智琦，Email：szqdalian@yahoo.com；于湛，Email：yuzhan@yahoo.com