他克莫司及金黄色葡萄球菌肠毒素B对特应性皮炎外周血Th17细胞的影响

喻泸 王华 罗晓燕

他克莫司及金黄色葡萄球菌肠毒素B对特应性皮炎外周血Th17细胞的影响

喻泸 王华 罗晓燕

目的探讨Th17细胞在急性期特应性皮炎(AD)患儿外周血单一核细胞(PBMC)中的表达，他克莫司和金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对AD患儿外周血Th17细胞的影响。方法分离急性期中、重度AD患儿及健康对照儿童PBMC，分别加入佛波酯和离子霉素、他克莫司、金黄色葡萄球菌肠毒素B培养，流式细胞仪检测Th17、Th1、Th2细胞比例，ELISA检测培养上清中IL-17、IFN-γ、IL-4表达，RT-PCR法检测Th17特异性核转录因子RORγt mRNA表达。结果佛波酯和离子霉素处理后，AD患儿外周血Th17、Th2细胞比例及相关细胞因子IL-17、IL-4水平明显高于健康对照组(P＜0.01)。Th1细胞比例及IFN-γ水平低于健康对照组(P＜0.01)，ROR γt mRNA高于健康对照组(P＜0.01)。 他克莫司处理后，AD组和对照组IL-17、IFN-γ、IL-4及ROR γt mRNA水平均显著降低(P＜0.01)。SEB处理后，AD组Th17细胞比例，IL-17和RORγt mRNA水平显著高于对照组(P＜0.01)，Th1细胞比例及IFN-γ水平低于对照组(P＜0.01)，Th2细胞比例及IL-4水平高于对照组(P＜0.01)。结论他克莫司对AD患儿和健康对照PBMC分泌IL-17、IFN-γ、IL-4均有明显的抑制作用。SEB增强AD患儿外周血Th17细胞表达。

皮炎，特应性；他克莫司；葡萄球菌，金黄色；肠毒素类；Th17细胞

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种与遗传有关的慢性复发性、瘙痒性、炎症性皮肤病，主要见于儿童和青少年，目前该病在发达国家患病率已接近20%[1]。近年来发现，Th17细胞参与慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等发病。AD患者存在皮肤屏障功能缺陷，伴有金黄色葡萄球菌(金葡菌)定植增加，金葡菌肠毒素B(SEB)作为超抗原能加重AD炎症，而Th17细胞在此过程中是否发挥免疫防御机制值得探讨。他克莫司作为一种免疫抑制剂，能缓解AD急性期炎症，是否通过抑制Th17细胞分化途径实现治疗目的尚不清楚。本研究旨在探讨Th17细胞在AD患儿外周血中的表达，他克莫司、SEB对外周血Th17细胞的影响。

对象与方法

一、对象

2011年11月至2012年11月于我院皮肤科门诊就诊的急性期AD患儿86例，其中男50例，女36例，年龄(0.25～14.75)岁，平均(5.39±4.04)岁，所有AD患儿均符合Hanifin-Rajka标准[2]，用欧洲特应性皮炎SCORAD评分标准对疾病严重度指数进行评估(总分103)，评分33～80，平均56.12±11.85。且在2周内未外用糖皮质激素类药物以及口服抗组胺药物，4周内未接受系统糖皮质激素或免疫抑制剂治疗。对照组81例均为本院体检的健康儿童，其中男48例，女 33例，年龄(2.92～14.08)岁，平均(5.65±2.02)岁，无特应性疾病史。本研究通过重庆医科大学伦理委员会批准，患儿家长签署知情同意书。

二、试剂与仪器

1.主要试剂：佛波酯和离子霉素(ionomycin)购于美国Alexis公司，他克莫司、SEB购于美国Sigma公司，淋巴细胞分离液购于天津TBD公司，胎牛血清购于美国Hyclone公司，RPMI1640培养液购于美国Gibeco公司，异硫氰基荧光素(FITC)标记的抗人CD8单抗、藻红蛋白-吲哚菁(PE-Cy5)标记的抗人CD3单抗 、藻红蛋白(PE)标记的同型对照IgG1单抗购于北京四正柏公司，藻红蛋白标记的抗人肿瘤坏死因子 γ(IFN-γ)、白介素 4(IL-4)，白介素 17(IL-17)单抗购于美国Ebioscience公司，细胞固定/破膜剂(Cytofix/Cytoperm)、细胞洗剂(Perm/Wash)、高尔基体阻断剂莫能霉素(Gal-stop monensin)购于美国BD公司。Trizol裂解液、反转录试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司，RORγt mRNA引物购于上海生工生物工程技术服务有限公司，PCR荧光染料(SsoFast EvaGreen Supermix)购于美国Bio-Rad公司，抗人 IFN-γ、IL-4、IL-17 ELISA 试剂盒购于美国CBS公司。

2.主要仪器：FACSCalibur流式细胞仪购于美国BD公司，实时荧光定量PCR仪购于美国Bio-Rad公司，ELISA检测仪购于美国BioTek公司。

三、方法

1.标本与细胞分离：急性期中、重度AD患儿及健康对照儿童外周血5 ml，肝素或EDTA抗凝，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单一核淋巴细胞(PBMC)，重悬于含100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培养液中，调整细胞浓度至2×109/L，培养于24孔板。

2.流式细胞仪检测Th细胞亚群：取上述细胞悬液(2×109/L)1 ml置于24孔板，分别加入佛波酯(50 μg/L)+离子霉素(1 mg/L)、金葡菌肠毒素B(20 mg/L)及莫能霉素(1 μmol/L)终浓度，37 ℃，50 ml/L CO2培养箱中培养(佛波酯+离子霉素组4 h、金葡菌肠毒素B组24 h)，移细胞悬液至1.5 ml微量离心管，1500 ×g，离心 5 min，弃上清，PBS洗2次后行流式细胞仪分析。Cell Quest软件分析数据。

3.ELISA检测培养上清细胞因子：分别加入佛波酯(50 μg/L)、离子霉素(1 mg/L)终浓度、他克莫司(1 μg/L)终浓度，金葡菌肠毒素B(1 mg/L)终浓度，37 ℃，50 ml/L CO2培养箱培养 24 h，1500 ×g，离心5 min，收集上清，-80℃保存。同时收集细胞沉淀至1.5 ml去酶微量离心管中。

4.实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测RORγt mRNA：于上述细胞沉淀中加入Trizol裂解液提取总RNA，反转录合成cDNA，染料法(EvaGreen)进行相对荧光定量。RORγt引物设计为F：5'-GTGCTGGTTAGGATGTGCCG-3'，R：5'-GTGG GAGAAGTCAAAGATGGA-3'，135 bp。 内参 GAPDH引物设计为F：5'-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG C-3'，R：5'-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGTGTC-3'，116 bp。通过建立RORγt mRNA和GAPDH mRNA标准曲线，计算获得各样本CT值(Y轴)与起始相对拷贝数的log值(X轴)曲线斜率slope和相关系数R2。扩增效率E=[10-1/slope-1]×100%。用美国Bio-Rad公司Gene Expression Analysis for iCycle iQ®实时PCR Detection System软件，计算各样本目的基因相对表达量。

5.统计分析：用SPSS17.0统计分析软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料均使用±s表示，组间比较用两独立样本t检验，各组年龄比较用方差分析，性别比较用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、外周血Th17/Th1/Th2细胞比例

佛波酯+离子霉素刺激培养PBMC 4 h，细胞膜表面标记和胞内细胞因子染色，流式细胞仪测定结果显示，AD患儿组(n=86)CD3+CD8-IL-17+(Th17)细胞比例高于健康对照组(n=81，P＜0.01)；CD3+CD8-IFN-γ+(Th1) 细胞比例低于健康对照组(P＜0.01)；CD3+CD8-IL-4+(Th2)细胞高于健康对照组(P＜0.01)。金葡菌肠毒素B(20 mg/L)刺激培养PBMC 24 h，流式细胞仪测定结果显示，AD患儿组Th17细胞比例高于健康对照组(P＜0.05)；Th1细胞比例低于对照组(P＜0.01)；Th2细胞比例高于对照组(P＜0.01)。见图1。

二、金葡菌肠毒素B对细胞培养上清IL-17/IFN-γ/IL-4的影响

金葡菌肠毒素B(1 mg/L)刺激PBMC 24 h，ELISA检测IL-17/IFN-γ/IL-4结果显示，AD组IL-17、IL-4水平明显高于健康对照组(P＜0.01)，IFN-γ水平明显低于健康对照组(P＜0.01)。见表1。

三、金葡菌肠毒素B对RORγt mRNA表达的影响

金葡菌肠毒素B(1 mg/L)刺激PBMC 24 h，RTPCR法检测RORγt mRNA表达结果显示，金葡菌肠毒素B处理后AD组(22例)明显高于健康对照组(18例)(1.51±1.05比0.39±0.28，P＜0.01)，差异有统计学意义。

四、他克莫司对培养上清细胞IL-17/IFN-γ/IL-4的影响

佛波酯 +离子霉素加或不加他克莫司(1 μg/L)刺激培养 PBMC 24 h，ELISA 检测培养上清细胞因子，结果显示，佛波酯+离子霉素处理后AD组IL-17和IL-4水平明显高于健康对照组，IFN-γ水平低于健康对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01)；佛波酯 +离子霉素+他克莫司处理后AD组和健康对照组IL-17、IFN-γ、IL-4水平均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

五、他克莫司对RORγt mRNA表达的影响

佛波酯+离子霉素加或不加他克莫司(1 μg/L)处理PBMC 24 h，RT-PCR法检测RORγt mRNA表达结果显示，佛波酯 +离子霉素处理后AD组RORγt mRNA表达明显高于健康对照组(P＜0.01)；佛波酯+离子霉素+他克莫司处理后AD组和健康对照组RORγt mRNA表达均显著降低(P＜0.01)。见表3。

讨 论

Th17细胞的主要特点是产生IL-17A(IL-17)、IL-17F、IL-22和IL-6等炎性细胞因子，其中以IL-17A为主。另外，Th17细胞的分化不依赖于Th1、Th2细胞特异性转录因子T-bet和GATA3，孤核受体(Orphan nuclear receptor，RORγt)是调控其分化的特异性转录因子[3]。IL-17是Th17细胞参与AD的主要效应细胞因子，Th17细胞可能通过增强Th2细胞功能、促进多种炎症因子分泌、增强角质形成细胞免疫活性等途径参与AD病理生理过程。

表1 金葡菌肠毒素B处理后白介素17、肿瘤坏死因子γ、白介素4水平(±s) pg/ml

注：a：与健康对照组比较，P＜0.01

组别 例数 白介素17 肿瘤坏死因子γ 白介素4健康对照组 24 284.23±84.69 943.98±254.07 274.51±48.67特应性皮炎组 24 593.50±119.16a548.46±99.70a462.71±109.63a

图1 表达白介素17、肿瘤坏死因子γ、白介素4的T细胞分析 1a：同型对照IgG设门；1b：表达白介素17；1c：表达肿瘤坏死因子γ；1d：表达白介素4

表2 他克莫司处理前后白介素17、肿瘤坏死因子γ、白介素4水平(±s) pg/ml

表2 他克莫司处理前后白介素17、肿瘤坏死因子γ、白介素4水平(±s) pg/ml

注：a：与健康对照组比较，P＜0.01；b：与佛波酯+离子霉素组比较，P＜0.01

组别 例数佛波酯+离子霉素+他克莫司健康对照组 22 369.57±107.22 147.66±67.69b 1123.66±218.36 380.67±128.54b 294.30±59.01 134.12±34.71b特应性皮炎组 22 638.01±152.85a 160.87±65.63b 653.53±133.80a 305.87±86.16b 537.15±160.73a 161.36±33.48b白介素17 肿瘤坏死因子γ 白介素4佛波酯+离子霉素佛波酯+离子霉素+他克莫司佛波酯+离子霉素佛波酯+离子霉素+他克莫司佛波酯+离子霉素

表3 他克莫司处理前后ROR γt mRNA表达(±s)

表3 他克莫司处理前后ROR γt mRNA表达(±s)

注：a：与健康对照组比较，P＜0.01；b：与佛波酯 +离子霉素组比较，P＜0.01

组别 例数 佛波酯+离子霉素佛波酯+离子霉素+他克莫司健康对照组 22 0.83±0.44 0.20±0.18b特应性皮炎组 24 2.64±2.31a 0.26±0.23b

本研究结果显示，AD患儿外周血Th2细胞和IL-4水平明显高于健康对照组，Th1细胞及IFN-γ水平低于对照组，提示急性期AD患儿外周血存在Th2细胞高表达。AD患者存在Th2细胞及相关细胞因子IL-4表达增加，Th1细胞及IFN-γ水平相对降低[4-5]，我们发现，急性期AD患儿外周血Th17细胞和IL-17表达也显著高于对照组，与Koga等[6]报道结果相同。另外，我们还发现AD患儿外周血Th17细胞特异性转录因子RORγt mRNA水平显著高于健康对照儿童。

研究报道，他克莫司能显著抑制正常人PBMC产生炎性细胞因子 IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和 TNF-α，在自身免疫性疾病的研究中，人们也发现他克莫司具有抑制初始T细胞向Th1、Th2、Th17细胞分化，减少其相关细胞因子合成的作用[7-8]。Kim等[9]发现他克莫司在早期移植物排斥反应中对Th1、Th2、Th17细胞并无明显抑制作用。Chung等[10]则发现他克莫司可抑制Th1和Th2细胞反应，并呈剂量依赖性，而对Th17细胞无论浓度多大均无抑制作用。因此，他克莫司对Th17细胞有无抑制作用尚存争议。本研究发现，他克莫司明显降低AD患儿和健康对照儿童外周血Th1、Th2细胞表达，减少IFN-γ和IL-4生成，同时对AD患儿及健康对照儿童Th17细胞均有明显抑制作用，减少IL-17合成，同时对Th17细胞关键核转录因子RORγt mRNA表达也有显著抑制作用，提示他克莫司通过抑制Th17细胞分化可能是实现缓解AD急性炎症的途径之一。

已知AD患者皮肤表面有大量金葡菌定植，金葡菌超抗原金葡菌肠毒素B能使初始CD4+T细胞前体向Th2细胞分化，产生B细胞级联反应，促使大量IgE产生，迁移至皮肤，Th2细胞释放的IL-4、IL-5趋化嗜酸性粒细胞向炎症部位皮肤聚集，继而产生IL-1，IL-6和IL-17，后者可正反馈加强Th2细胞数量及分化规模，从而参与AD急性炎症进程[11]。本研究结果显示，金葡菌肠毒素B体外刺激PBMC后，与健康对照相比，AD患儿组Th2细胞亚群及其相关因子IL-4表达升高。Ma等[12]发现，Th17细胞缺陷的个体更易受金葡菌感染，AD患者皮肤斑贴试验处分离出来的浸润性T细胞可产生IL-17。体外培养发现，金葡菌肠毒素B对IL-17产生具有促进作用，提示Th17细胞可能对抗金葡菌感染有一定的防御作用。我们发现，金葡菌肠毒素B处理后AD组患儿Th17细胞特异性核转录因子RORγt mRNA和IL-17水平均显著高于对照组，提示Th17/IL-17可能是金葡菌肠毒素B加重AD炎症的途径之一，为此我们下一步拟对IL-17受体进行阻断后证实。

[1]Larché M.Regulatory T cells in allergy and asthma[J].Chest，2007，132(3):1007-1014.

[2]Hanifin JM.Diagnostic features of atopic dermatitis[J].Acta Derm Venereol(Stockh)，1980，92(1):44-47.

[3]Ivanov II，McKenzie BS，Zhou L，et al.The orphan nuclear receptorRORgammatdirectsthedifferentiation program of proinflammatory IL-17+T helper cells[J].Cell，2006，126(6):1121-1133.

[4]张丽，林俊萍，赵丽萍，等.特应性皮炎患者外周血表达不同细胞因子T细胞亚群的检测[J].中华皮肤科杂志，2008，41(1):19-21.

[5]Kobayashi T，Momoi Y，Iwasaki T.Cyclosporine A inhibits the mRNA expressions of IL-2，IL-4 and IFN-gamma，but not TNF-alpha，in canine mononuclear cells[J].J Vet Med Sci，2007，69(9):887-892.

[6]Koga C，Kabashima K，Shiraishi N，et al.Possible pathogenic role of Th17 cells for atopic dermatitis[J].J Invest Dermatol，2008，128(11):2625-2630.

[7]Park KY，Kim DH，Jeong MS，et al.Changes of antimicrobial peptides and transepidermal water loss after topical application of tacrolimus and ceramide-dominant emollient in patients with atopic dermatitis[J].J Korean Med Sci，2010，25(5):766-771.

[8]Tsuda K，Yamanaka K，Kitagawa H，et al.Calcineurin inhibitors suppress cytokine production from memory T cells and differentiation of naïve cells into cytokine-producing mature T cells[J/OL].PloS One，2012，7(2):e31465[2012-02-16].http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0031465

[9]Kim HY，Cho ML，Jhun JY，et al.The imbalance of T helper 17/regulatory T cells and memory B cells during the early posttransplantation period in peripheral blood of living donor liver transplantation recipients under calcineurin inhibitor-based immunosuppression[J].Immunology，2013，38(2):124-133.

[10]Chung BH，Kim KW，Kim BM，et al.Dysregulation of Th17 cells during the early post-transplantperiod in patients under calcineurin inhibitor based immunosuppression[J/OL].PLoS One，2012，7(7):e42011[2012-07-25].http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0042011

[11]Wang YH，Angkasekwinai P，Lu N，et al.IL-25 augments type 2 immune responses by enhancing the expansion and functions of TSLP-DC-activated[J].J Exp Med，2007，204(8):1837-1847.

[12]Ma CS，Chew GY，Simpson N，et al.Deficiency of Th17 cells in hyper IgE syndrome due to mutations in STAT3[J].J Exp Med，2008，205(7):1551-1557.

2013-08-20)

(本文编辑:吴晓初)

Effect of tacrolimus andStaphylococcus aureusenterotoxin B on T helper 17 cells in peripheral blood from patients with atopic dermatitis

Yu Lu，Wang Hua，Luo Xiaoyan.Department of Dermatology，Children's Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China

Luo Xiaoyan，Email:luoxycq@hotmail.com

ObjectiveTo determine the proportion of T helper 17(Th17)cells in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)from children with acute atopic dermatitis(AD)，and to evaluate the effect of tacrolimus andStaphylococcus aureusenterotoxin B(SEB)on the proportion.MethodsPBMCs were separated from 86 children with moderate to severe acute AD and 81 healthy children，and cultured in the presence of phorbol ester(PMA)and ionomycin with or without tacrolimus or SEB for different durations.Then，flow cytometry was performed to determine the proportions of Th17，Th1 and Th2 cells，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to measure the levels of interleukin(IL)-17，interferon(IFN)-γ and IL-4 in the culture supernatant of these cells，and real-time fluorescence-based quantitative PCR(RT-PCR)to detect the expression level of RORγt mRNA.Statistical analysis was done by using two independent samplest-test，chi-square test and analysis of variance.ResultsAfter stimulation with PMA and ionomycin，there was a significant increase in the proportions of Th2 and Th17 cells in，supernatant levels of IL-17 and IL-4 and mRNA expression level of RORγt of，but a significant decrease in Th1 cell percentage in and IFN-γ supernatant level of，PBMCs from patients with AD compared with PBMCs from the healthy controls(allP＜0.01).The combination treatment with tacrolimus significantly reduced the supernatant levels of IL-17，IFN-γ，IL-4 and RORγt mRNA expression level of PBMCs from both the patients and healthy controls compared with those treated with PMA and ionomycin only(allP＜0.01).In comparison with the healthy controls，the patients with AD showed significantly higher proportions of Th17 and Th2 cells in，supernatant levels of IL-17 and IL-4 of，and expression level of RORγt mRNA of，but significantly lower proportion of Th1 cells in and IFN-γ supernatant level of，PBMCs after SEB treatment(allP＜0.01).ConclusionsTacrolimus evidently inhibits the secretion of IL-17，IFN-γ and IL-4 by PBMCs from both children with AD and healthy children，while SEB can up-regulate the proportion of peripheral blood Th17 cells in children with AD.

Dermatitis，atopic；Tacrolimus；Staphylococcus aureus；Enterotoxins；Th17 cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.011

重庆市卫生局面上项目(2009-2-242)；2010年中华医学会皮肤性病分会-安斯泰来皮肤病学研究基金

400014重庆医科大学附属儿童医院皮肤科

罗晓燕，Email：luoxycq@hotmail.com