84株感染相关皮肤病MRSA SCCmec分型及PVL毒素检测

郭利平 王晓彦

84株感染相关皮肤病MRSA SCCmec分型及PVL毒素检测

郭利平 王晓彦

目的探讨感染相关皮肤病耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的SCCmec基因型别及PVL毒素携带情况。方法分离于感染相关皮肤病MRSA菌株及其相关信息，对所收集到的菌株利用PCR方法进行mecA鉴定，mecA阳性者确定为实验对象，再通过多重PCR的方法进行SCCmec基因分型及PVL毒素的测定。结果共收集95株MRSA，经鉴定mecA阳性者为84株，其中有5株携带PVL毒力基因。有69株为SCCmecⅢ型，占 86.3%(69/84)，有 3株为 SCCmecⅠ型，占 3.6%(3/84)，有 8株为 SCCmecⅣ型，占 9.52%(8/84)，其余4株为不可分型，占4.8%(4/84)。未发现SCCmecⅡ、Ⅴ两型。结论感染相关皮肤病MRSA以HA-MRSA为主，SCCmec分型大部分为Ⅲ型，CA-MRSA及HA-MRSA均可携带PVL毒素。

感染；皮肤；基因，SCCmec；PVL毒素

1961年Jevons在英国首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)，20世纪60年代中期 MRSA扩展到欧洲许多国家及加拿大，20世纪70年代末急剧增多遍及全世界，成为全球性问题[1]。随着耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistantStaphylococcus aureus，VRSA)的出现，MRSA 的治疗更加棘手。20世纪90年代开始，社区获得性MRSA(CA-MRSA)感染现象有所增多，与医院获得性MRSA(HA-MRSA)不同，这种MRSA经常在没有医院经历和院内感染可能的健康人群(多数为小孩)中分离获得，而且呈增长的趋势[2]。它是导致皮肤及软组织感染的主要原因，另外，CA-MRSA携带杀白细胞毒素(panton-valentine leukocidin，PVL)，PVL 常见于CA-MRSA引起的严重的深部皮肤感染等[3]。我们通过分离皮肤软组织感染相关皮损的MRSA进行SCCmec基因分型及PVL毒素的检测，探讨本院感染相关皮肤病流行株的SCCmec型别，为治疗MRSA感染提供一定依据。

材料与方法

一、菌株来源

收集内蒙古医科大学附属医院2010年6月至2012年7月，与皮肤软组织感染相关的皮损分泌物(包括感染性皮肤病其他科室与皮肤感染相关疾病，如手术切口感染，褥疮等)及其临床资料(包括患者姓名、性别、皮损初发部位及临床诊断)，同时测定其C-反应蛋白(CRP)，培养出金黄色葡萄球菌且CRP阳性者确定为致病菌[4]，最终得出致病性金黄色葡萄球菌338例，其中MRSA 95例，所有菌株均为非重复菌株，同一患者同一部位只取1次分离株。质控菌株金黄色葡萄球菌 ATCC25923，MRSAATCC43300均来自内蒙古医科大学附属医院检验科细菌室。

二、主要试剂及仪器

细菌基因组提取试剂盒、溶葡球菌酶、2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、100 bp DNA Ladder、 琼脂糖、核酸染料均购自南京博尔迪生物科技有限公司。试验所用引物均参照相关文献由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增仪(PTC-100)、DYY-6C型电泳仪、电泳成像分析系统等由内蒙古农牧科学院分子实验室提供。

三、方法

1.临床标本取材：开放性感染和已破溃的化脓灶：先用生理氯化钠液冲洗表面的污染菌，用无菌拭子取化脓组织与正常组织交界处的脓液及皮损深部的分泌物，立即送检。闭锁性脓肿：先用2.5%的碘伏及75%的乙醇消毒脓肿表面及周围皮肤，然后用无菌注射器穿刺取其内容物，立即送检。

2.MRSA基因组DNA模板提取：将已冻存的菌株重新接种在哥伦比亚血平板上，置37℃温箱中孵育18～24 h。用灭菌环从血平板上挑取8～10个复活菌落溶于300 μl的溶葡萄球菌酶中，分别标号后置37℃温箱水浴30 min，取出放入100℃沸水中小火煮沸10 min，10 800×g离心5 min，然后按照细菌DNA提取试剂盒的第3步操作开始提取DNA，最后保存在-20℃冰箱中。

3.mecA基因检测：①mecA基因扩增引物参考文献 [5]合成：MECAP4：5'-TCCAGATTACAACTT CACCAGG-3'，MECAP7：5'-CCACT TCATATCTTGTAAGG-3'，扩增片段大小约为162 bp；②PCR扩增条件为94℃初变性 4 min，94℃变性30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸4 min，1.5%琼脂糖电泳。

4.SCCmec基因分型：参照Boye等[6]方法，用多重PCR的方法对MRSA菌株进行SCCmec分型，所用引物见表1。结果判读方式：SCCmecⅠ型只显示415 bp条带，SCCmecⅡ型只显示 937 bp条带，SCCmecⅢ型只显示518 bp条带，SCCmecⅣ型同时显示415 bp和937 bp条带，SCCmecⅤ型同时显示359 bp和518 bp条带。

5.PVL基因测定：①PVL基因扩增引物参考文献[7]合成：Luk-PV-1：5'-ATCATTAGGTAAAATGA CTGGACATGATCCA-3'，Luk-PV-2：5'-GCATCAAS TGTATTGGATAGCAAAAG-3'，扩增片段大小约为433 bp；②PCR扩增条件为94℃初变性4 min，94 ℃变性30 s，53℃退火 30 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸4 min，1.5%琼脂糖电泳。

结 果

1.mecA基因检测结果：复活的95例MRSA经PCR扩增后，mecA基因阳性的为84株。结合临床资料分析，CA-MRSA有21例，HA-MRSA有63例，PCR扩增产物电泳图见图1。

2.SCCmec基因分型多重PCR扩增结果：利用多重PCR的方法对mecA阳性的84株MRSA进行SCCmec基因Ⅰ-Ⅴ型扩增，其分型结果见表2。SCCmec基因分型PCR扩增产物部分电泳图见图2。

表1 SCCmec分型所用引物

图1 mecA基因PCR扩增产物电泳图 M：标准参照物；1～19：菌株编号，10、12、13、19号菌株mecA基因阴性，其余均为阳性

表2 SCCmec基因分型结果(株)

图2 SCCmec基因分型PCR扩增产物电泳图 M：标准参照物；1，33：SCCmecⅣ型； 9：SCCmecⅠ型； 10 ～ 12，16，20 ～ 25，29 ～ 30，37：SCCmecⅢ型； 31： 未分型； +：SCCmecⅢ型阳性对照；-：阴性对照

3.PVL基因检测结果：对84株MRSA进行PVL基因特异性扩增后，共检测出5株PVL基因阳性的菌株，占5.6%(5/84)，其中CA-MRSA有3株，占所有收集的CA-MRSA菌株的14.3%(3/21)，HAMRSA有2株，占所有收集的HA-MRSA菌株的3.2%(2/63)。对这两组MRSA菌株PVL表达率做χ2检验分析，P＞0.05。PVL基因扩增产物片段为433 bp。

讨 论

SCCmec是耐药性基因插入、堆积的部位，主要由mecA基因复合体、盒式染色体重组酶基因和无功能区(J区)三部分构成[8]。依据mecA和盒式染色体重组酶基因复合体的多态性目前SCCmec可分为Ⅰ～Ⅴ型，根据J区的不同又可以分为不同的亚型。SCCmecⅠ、SCCmecⅡ和SCCmecⅢ型常存在于HA-MRSA中，可携带多个耐药基因。SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型通常存在于CA-MRSA中，除了mecA基因外很少携带其他耐药基因，因此CAMRSA通常不表现多重耐药。

本次研究显示，内蒙古医科大学附属医院皮肤感染分离的MRSA有3型，分别为SCCmecⅠ型、SCCmecⅢ、SCCmecⅣ型，以 SCCmecⅢ型为主，与国内其他地区及其他亚洲国家报道结果一致。其中SCCmecⅢ型中有57株为HA-MRSA，多数为骨科创口感染所致，12株为CA-MRSA，这可能与SCCmec分型存在地区差异有关，但也不能排除此12株CAMRSA为HA-MRSA的可能性。SCCmecⅣ型均为CA-MRSA，来源于皮肤科门诊，分别为疖肿2例，蜂窝组织脓肿1例，虫咬皮炎合并感染1例，湿疹合并感染4例。

PVL是由携带PVL基因金黄色葡萄球菌产生的一种外毒素，由S和F蛋白组成，是金葡菌的重要致病因子[9]。本研究显示，84株MRSA中共检测出5株PVL阳性的菌株，占5.9%，与国内报道一致。其中 CA-MRSA 3株，HA-MRSA 2株，经χ2检验分析P＞ 0.05，CAMRSA与HA-MRSA两组菌株PVL基因表达率的差异无统计学意义。回顾临床资料分析，这3株CAMRSA均来自皮肤科门诊，1例为疖肿，1例为蜂窝组织脓肿，1例为虫咬皮炎合并感染，经抗生素治疗预后良好，但较其他未携带PVL毒素的患者恢复较慢。本研究只对SCCmecI-V型基因进行扩增，而未对其他新型别的基因进行扩增。我们在分型过程中有4株不可分型，可能是除这5型以外的其他型别。

[1]Vyas K，Hospenthal DR，Mende K，et al.Recurrent communityacquired methicillin-resistantStaphylococcus aureusinfections in an HIV-infected person[J].J Clin Microbiol，2011，49(5):2047-2053.

[2]Forcade NA，Parchman ML，Jorgensen JH，et al.Prevalence，severity，and treatmentofcommunity-acquired methicillinresistantStaphylococcus aureus(CA-MRSA)skin and soft tissue infections in 10 medical clinics in Texas:a South Texas Ambulatory Research Network(STARNet)study[J].J Am Board Fam Med，2011，24(5):543-550.

[3]Nonga BN，Jemea B，Tambo FM，et al.Feasibility of a simple drainage system in Cameroonian children after thoracotomy and decortication for empyema thoracis[J].Afr J Paediatr Surg，2012，9(1):27-31.

[4]漆坚，周淑梅.C-反应蛋白在协助鉴别病原菌中的应用价值[J].实验与检验医学，2008，26(5):571.

[5]Zhang K，McClure JA，Elsayed S，et al.Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec Types I to V in methicillin-resistantStaphylococcus aureus[J].J Clin Microbiol，2005，43(10):5026-5033.

[6]Boye K，Bartels MD，Andersen IS，et al.A new multiplex PCR for easy screening of methicillin-resistantStaphylococcus aureusSCCmec types I-V[J].Clin Microbiol Infect，2007，13(7):725-727.

[7]Motoshima M，Yanagihara K，Morinaga Y，et al.Genetic diagnosis ofcommunity-acquired MRSA:amultiplexreal-timePCR method forStaphylococcal cassettechromosome mec typing and detecting toxin genes[J].Tohoku J Exp Med，2010，220(2):165-170.

[8]师志云，赵志军，贾伟，等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子流行病学研究[J].中华医院感染学杂志，2011，21(14):2886-2888.

[9]Montgomery CP，Daum RS.Transcription of inflammatory genes in the lung after infection with community-associated methicillinresistantStaphylococcus aureus:a role for panton-valentine leukocidin？[J].Infect Immun，2009，77(5):2159-2167.

2013-05-05)

(本文编辑：吴晓初)

Staphylococcal cassette chromosome mec typing of and detection of PVL gene in 84 methicillin-resistantStaphylococcus aureusisolates from patients with infectious skin diseases

Guo Liping*，Wang Xiaoyan.*Department of Dermatology，Center Hospital of Erdos City，Erods 017000，Inner Mongolia，China

Wang Xiaoyan，Email:xiaoyan4766@hotmail.com

ObjectiveTo determine staphylococcal cassette chromosome mec(SCCmec)types and detect panton-valentine leukocidin(PVL)gene in methicillin-resistantStaphylococcus aureus(MRSA)isolates from patients with infectious skin diseases.MethodsStaphylococcus aureuswas isolated from lesion exudate of patients with infectious skin diseases between June 2010 and July 2012 in different departments of Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University.General and medical information on the patients was collected as well.PCR was performed to detect mecA gene in MRSA strains，and multiplex PCR was conducted to determine SCCmec type and detect PVL gene in mecA gene-positive strains.ResultsA total of 95 MRSA strains were isolated from these patients with infectious skin diseases，and mecA gene was found in 84 out of these strains.Among these mecA-positive strains，5 carried PVL gene，69(86.3%)were identified as SCCmec type Ⅲ，3(3.6%)as SCCmec typeⅠ，8(9.52%)as SCCmec type Ⅳ，4(4.8%)were non-typeable，and no strain was identified as SCCmec typeⅡ orⅤ.ConclusionsHospital-acquired(HA)-MRSA predominates in MRSA strains causing infectious skin diseases，with SCCmec typeⅢas the major SCCmec type.Both HA and community-acquired(CA)MRSA strains carry PVL toxin.

Infection；Skin；Genes，SCCmec；PVL toxin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.009

017000内蒙古自治区鄂尔多斯市中心医院皮肤科(郭利平)；内蒙古医科大学附属医院皮肤性病科(王晓彦)

王晓彦，Email：xiaoyan4766@hotmail.com