四君子汤对脾虚证大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡及C aspase⁃3表达的影响

赵盛云 ，王垂杰

（1.辽宁中医药大学研究生学院，沈阳 110847；2.中国医科大学附属第一医院中医科，沈阳 110001；3.辽宁中医药大学附属医院消化科，沈阳 110032）

在中医消化领域，脾虚证主要是指因脾胃气虚，受纳、腐熟、运化功能失常所致的胃脘疼痛、腹胀、纳呆、恶呕、嗳气、便溏等一组中医证候。脾虚证是慢性胃炎和胃溃疡等慢性胃病最常见的中医证型［1～3］。慢性胃病的发生是由于胃黏膜损伤因素和胃黏膜防御机制之间平衡的破坏，特别是胃黏膜屏障防御功能的破坏所致。慢性胃病发病过程中，黏膜损伤的慢性过程也很符合脾虚证具有的慢性的、虚性的与正常体质呈渐变关系的病理特点。目前，对胃黏膜和黏液屏障与脾虚证相关性的系统性研究较少见［4］。本研究通过比较脾虚证大鼠药物干预前后胃黏膜上皮细胞凋亡变化情况和Caspase⁃3的变化情况，揭示了脾虚证与胃黏膜屏障的关系及其在慢性胃病发病过程中的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD大鼠102只，体质量180～210 g，雌雄各半，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供［动物合格证号：SCXK（京）2009⁃0004］。饲养条件符合实验动物国家相关标准：室温20～24℃，12 h光照维持，昼夜循环。

1.1.2 药物：小承气汤由厚朴、枳实、大黄（比例3∶3∶2）［5］组成；四君子汤由党参、白术、茯苓、甘草（比例2∶2∶2∶1）组成。中药材均由辽宁中医药大学附属医院药剂科提供，并由该院制剂室制成100%煎剂，4 ℃冰箱保存备用。Caspase⁃3 Antibody、SABC试剂盒和DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.1.3 仪器与软件：Leica Q550CW图象采集和分析系统（德国徕卡公司）。数码显微镜（OBX41）和生物显微镜（CHA）（日本OLYMPUS公司）。应用SPSS11.0进行数据统计。

1.2 方法

1.2.1 动物分组：大鼠适应性饲养l周后，随机分成4组，正常对照组24只，长期造模组、自然恢复组和四君子汤组各26只。

1.2.2 动物模型的制备：脾虚证模型建立采用耗气破气药物、饥饱失常和劳累三因素复合造模法，即小承气汤（1.5 mL/100 g）隔日1次灌胃，灌胃当日禁食，次日足量喂食且游泳至耐力极限。

1.2.3 给药方法：正常对照组大鼠常规饲养，前4周生理盐水1.5 mL/100 g隔日1次灌胃，后3周生理盐水1.5 mL/100 g每日1次灌胃共7周。长期造模组大鼠以上述造模方法喂养7周。自然恢复组前4周喂养方法同长期造模组，后3周改为常规喂养。四君子汤组喂养方法前4周同长期造模组，后3周改为常规饲养的同时用四君子汤1.5 mL/100 g每日1次灌胃。于第7周末处死大鼠后取材处理。

1.2.4 指标检测：采用TUNEL法检测胃黏膜上皮细胞的凋亡情况。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性。于凋亡阳性细胞分布区域，光镜（×400）下随机选择5个互不重叠的视野，测定单位面积阳性细胞表达的光密度（OD）值作为其表达情况的指标。采用ABC免疫组化法检测Caspase⁃3表达情况，细胞核染为棕黄色者为阳性染色，光镜下计数阳性细胞数。

1.3 统计学分析

应用SPSS11.0进行数据统计。所得数据符合正态分布的计量资料以±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析。P＆lt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡情况

与正常对照组比较，各组大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡均增加，尤以长期造模组增加显著，差异有统计学意义（P＆lt;0.05）。经四君子汤治疗后，大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡明显减少，与长期造模组及自然恢复组比较有统计学差异（P＆lt;0.05）。

表1 各组大鼠胃黏膜细胞凋亡情况的比较（±s）Tab.1 Comparison of programmed cell death level in rat gastric mucosa（±s）

表1 各组大鼠胃黏膜细胞凋亡情况的比较（±s）Tab.1 Comparison of programmed cell death level in rat gastric mucosa（±s）

1）compared with the normal control group，P＆lt;0.05；2）com⁃pared with the Sijunzi decoction group，P＆lt;0.05.

Group n OD Normal control group 8 2.13±0.183 Long⁃term model group 8 29.95±0.6481），2）Natural recovery group 8 25.13±0.4131），2）Sijunzi decoction group 8 18.45±0.5731）

2.2 各组大鼠胃黏膜组织Caspase⁃3含量的变化

与正常对照组比较，各组大鼠胃黏膜组织Cas⁃pase⁃3含量均升高，差异有统计学意义（P＆lt;0.05）。经四君子汤治疗后，大鼠胃黏膜组织Caspase⁃3含量明显降低，与长期造模组及自然恢复组比较有统计学差异（P＆lt;0.05）。

表2 各组大鼠胃黏膜组织Caspase⁃3含量的比较（±s）Tab.2 Comparison of Caspase⁃3 level in the rat gastric mucosa（±s）

表2 各组大鼠胃黏膜组织Caspase⁃3含量的比较（±s）Tab.2 Comparison of Caspase⁃3 level in the rat gastric mucosa（±s）

1）compared with the normal control group，P＆lt;0.05；2）compared with the Sijunzi decoction group，P＆lt;0.05.

Group n Caspase⁃3 Normal control group 8 0.176 0±0.004 6 Long⁃term model group 8 0.235 6±0.005 01），2）Natural recovery group 8 0.214 0±0.007 61），2）Sijunzi decoction group 8 0.207 0±0.003 81）

3 讨论

作为营养通道，胃之所以能够在生理范围内经受高温食物、高渗与低渗液体、高浓度酒精、吸烟、非甾体类抗炎药、胃酸及消化蛋白酶等各种内源性、外源性物质的刺激与挑战，得益于胃具有与其功能相适应的胃黏膜屏障防御体系［6］。Wallance等［7］将参与胃黏膜防御的各种因素分为5级，其中细胞凋亡对黏膜上皮、腺体的损伤、再生、修复有很大的影响，在胃黏膜屏障的第5道防线中起重要作用。本研究选取的观测指标Caspase⁃3作为最重要的效应Caspase，是Caspase家族中最重要的凋亡执行者，是多种凋亡刺激信号传递的终结点，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必由之路，因此是细胞凋亡中的关键酶。

本研究中大鼠胃黏膜在遭受致病因子的侵袭后，黏膜Caspase⁃3含量明显增加，同时细胞凋亡增加，细胞凋亡与细胞增殖间的平衡受到破坏，局部黏膜细胞数量减少，黏膜屏障保护功能下降，造成胃黏膜疾病的发生。这说明通过施加耗气破气药物灌胃、饥饱失常和劳累过度这些伤脾害胃的造模因素，使得大鼠具备了扎堆、眯眼、食少、便溏等脾虚症状后，其胃黏膜的防御机制的微观指标随之发生变化，从而导致胃黏膜屏障功能的下降，进一步导致慢性胃病的发生。自然恢复组大鼠造模后胃黏膜Caspase⁃3含量下降，后期通过自我修复机制，在一定程度上减少了胃黏膜细胞凋亡，修复了黏膜屏障，但仍未恢复到正常水平。四君子汤组经过治疗后，大鼠一系列脾虚症状明显好转，胃黏膜局部Caspase⁃3含量下降，凋亡情况好于自然恢复组。说明四君子汤通过益气健脾改善了大鼠脾虚证，同时增强了其胃黏膜屏障功能，减少了损伤的胃黏膜的细胞凋亡，从而对慢性胃病起到治疗作用。这就为探索中药胃黏膜保护剂和健脾益气中药的临床应用提供了实验依据，对提高慢性胃病临床疗效及减少慢性胃病的发病具有一定指导意义。

［1］冯群法，闫杰，吴积海.中医辨证治疗消化性溃疡65例［J］.中医研究，2009，22（4）：43-44.

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［3］张声生，陈贞，许文君，等.基于“寒、热、虚、实”二次辨证的565例功能性消化不良证候分布特点研究［J］.中华中医药杂志，2008，23（9）：833-835.

［4］王晓娜，朱方石.脾虚与胃黏膜防御机制相关性的研究进展及评价［J］.辽宁中医杂志，2010，37（6）：1176-1179.

［5］傅湘琦，侯燕鸣.依据中医耗气破气和饮食失节的理论塑造大白鼠“脾气虚证”模型的形态学研究［J］.天津中医，1991，8（3）：21-22.

［6］徐婷婷，朱方石.外源性胃粘膜损伤因素与脾虚相关性的研究进展［J］.世界华人消化，2010，18（28）：2981-2984.

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