高脂饲养胰岛素抵抗大鼠血清Apelin⁃36水平的变化

陈薇，赵晓娟，王楠楠，刘项楠

（1.中国医科大学附属第一医院内分泌科，沈阳 110001；2.辽宁省人民医院血液科，沈阳 110016）

长久以来，胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷被认为是2型糖尿病发病的关键因素。近年研究认为，氧化应激、炎性反应与脂肪内分泌相互作用，从而引起胰岛素抵抗和β细胞功能障碍。因此，对上述机制进行研究成为实验研究及临床治疗的一个热点。目前由于脂肪组织内分泌功能活跃，脂肪内分泌学科已经成为内分泌学的一个崭新领域。很多的研究发现脂肪细胞通过活跃的分泌功能在调节能量代谢和胰岛素抵抗方面发挥重要作用［1］。Apelin是近年新发现的脂肪因子，它是Tatemoto等利用反向药理学的方法从牛胃的分泌物中提取并纯化了的血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白（angioten⁃sinⅡtype 1 receptor⁃associated protein，APJ）的内源性配体［2］。Apelin既受胰岛素调控，又可抑制高血糖刺激下的胰岛素分泌［3］。更多直接的证据表明它能增加胰岛素敏感性及周围组织对葡萄糖的摄取。但目前对于Apelin/APJ系统在脂代谢紊乱、胰岛素抵抗（insulin risistence，IR）、糖尿病、高血压、炎症等病理生理过程中的作用机制尚不十分清楚。目前，对于Apelin的研究多围绕于已发生2型糖尿病的患者或动物模型，本研究定位于最早期出现并伴随着整个2型糖尿病发展过程的胰岛素抵抗状态，通过建立胰岛素抵抗大鼠模型，测定其血清胰岛素、Apelin⁃36、游离脂肪酸水平，探讨在胰岛素抵抗状态时是否有Apelin的代偿性分泌增加。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性Wistar大鼠40只，体质量（230±20）g，由辽宁长生生物技术有限公司提供。饲养于中国医科大学实验动物中心屏障系统中，室温（23±2）℃，湿度60%左右，明暗交替周期12 h，自由取食水。以基础饲料（热量比：蛋白质28.58%，脂肪9.59%，碳水化合物61.83%）适应性喂养1周。

1.1.2 主要试剂和仪器：胰岛素放射免疫分析药盒购于原子高科技股份有限公司。大鼠Apelin⁃36 ELISA试剂盒、大鼠游离脂肪酸ELISA试剂盒购自RD公司。胰岛素放射免疫分析药盒购自原子高科技股份有限公司。仪器包括微量输液泵、全波长酶标仪、紫外分光光度仪。

1.2 方法

1.2.1 建立胰岛素抵抗大鼠模型：大鼠适应性喂养1周后，按随机数据表分为正常对照组（NC组，n=15）和胰岛素抵抗组（HF组，n=15）。NC组给予基础饲料喂养，HF组给予高脂饲料喂养诱导胰岛素抵抗模型。高脂饲料由基础饲料+猪油+奶粉配制，热量比为蛋白质14%、脂肪59%、碳水化合物27%。配制好的高脂饲料经钴源照射，密封保存。每周检测体质量，共10周。

1.2.2 高胰岛素正葡萄糖钳夹实验：喂养10周后，NC组、HF组各随机抽取5只，采用高胰岛素—正葡萄糖钳夹实验，了解大鼠葡萄糖输注率的变化，评估胰岛素抵抗模型，具体方法参照文献［4］。实验前禁食14 h后，10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔内麻醉。麻醉成功后固定，颈部和左腹股沟区备皮。剪开右侧颈部皮肤及左侧腹股沟皮肤，分离暴露右颈总动脉和左股静脉，然后进行右颈总动脉和左股静脉插管，插管成功后固定套管针，左颈总动脉接肝素生理盐水注射器，右股静脉接三通管后分别接装有人胰岛素注射液（40 mU/mL）和10%葡萄糖注射液的50 mL注射器，再接微量输液泵，静置30 min后，颈总动脉取血（1 mL）测基础血糖和基础胰岛素。首先输注胰岛素，输注率1.67 mU/（kg·min），每5 min颈总动脉取血（1滴）测血糖。当血糖＆lt;（基础值±0.5）mmol/L时开始输注葡萄糖。葡萄糖输注率（glucose infusion rate，GIR）从4～6 mg/（kg·min）开始，每5 min测血糖1次，调整GIR，使血糖保持在（基础值±0.5）mmol/L。连续3次血糖都在上述范围内，钳夹形成。实验共计约2 h，计算60～120 min的平均GIR，以评价胰岛素的敏感性。

1.2.3 标本采集与检测：2组各剩余的10只大鼠禁食14 h，测定空腹尾尖血糖（fasting blood glucose，FBG）；10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔内注射麻醉，内眦静脉采血，分离血清，应用胰岛素放免药盒检测血清胰岛素水平，ELISA法测定血清Apelin⁃36、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）水平。钳夹实验结束后剖杀动物，完整剥离大鼠附睾脂肪，电子天平称重，计算附睾脂肪质量占体质量的比例（g/g），即附睾脂肪质量指数。取出肾周组织，剔除血管和其他结缔组织，将脂肪组织清洗后蘸干，用液氮迅速冷冻后，-70℃冰箱保存。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 高胰岛素正葡萄糖钳夹实验节

喂养10周后行钳夹实验，HF组大鼠平均GIR显著低于 NC 组［（1.17±0.36） mg· kg-1· min-1和（3.72±0.37）mg· kg-1· min-1，P＆lt;0.01］，胰岛素抵抗大鼠模型建立成功。

2.2 2组大鼠各项指标比较

大鼠喂养10周后，HF组较NC组体质量明显升高［（582.28±30.77）g和（513.42±41.00）g，P＆lt;0.01］、附睾脂肪质量指数明显升高［（1.11±0.96）%和（0.75±0.11）%，P＆lt;0.01］。2组大鼠基础血糖比较无统计学差异（P＆gt;0.05）。HF组血清基础胰岛素、Apelin⁃36及游离脂肪酸较NC组均明显升高（P＆lt;0.01），见表1。

2.3 2组大鼠检测指标的相关性分析

血清Apelin⁃36与基础胰岛素、游离脂肪酸、附睾脂肪质量指数呈正相关（r1=0.452，P＆lt;0.05；r2=0.637，P＆lt;0.01；r3=0.756，P＆lt;0.01）。

3 讨论

胰岛素抵抗是2型糖尿病早期表现，并贯穿于糖尿病始终。胰岛素抵抗是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降。摄食过多（尤其脂肪过多）、体力活动不足易导致肥胖及胰岛素敏感性降低。本研究采用高脂饲料喂养大鼠10周后成功建立胰岛素抵抗模型，HF组较NC组体质量明显升高（P＆lt;0.01），高胰岛素正葡萄糖钳夹实验结果显示HF组大鼠平均葡萄糖输注率显著低于NC组（P＆lt;0.01），提示高脂摄入能够成功制成胰岛素抵抗和肥胖模型。附睾脂肪质量指数常用于评估内脏脂肪含量，本实验结果表明高脂饮食明显高于正常饮食组，提示长期高脂饮食导致的肥胖为内脏脂肪性肥胖。此外，研究［5］显示高胰岛素血症和高游离脂肪酸是肥胖者胰岛素抵抗的重要特征，本研究测得HF组大鼠血清基础胰岛素、游离脂肪酸水平均明显高于NC组（P＆lt;0.01），与此特征相符。

表1 2组大鼠实验室指标的比较（±s）Tab.1 Laboratory index contrast of rats between group NC and HF（±s）

表1 2组大鼠实验室指标的比较（±s）Tab.1 Laboratory index contrast of rats between group NC and HF（±s）

1）P＆lt;0.01 vs NC group.FBG，fasting blood glucose；INS，insulin；FFA，free fatty acid.

Group n Body mass Epididymal FBG INS Apelin⁃36 FFA（g） fat mass index（%） （mmol/L） （mIU/L） （ng/mL） （μmol/L）NC 10 513.42±41.00 0.75±0.11 5.06±0.47 9.35±2.28 0.53±0.07 264.11±12.59 HF 10 585.28±30.771） 1.11±0.961） 5.28±0.58 14.69±4.431） 0.63±0.051） 301.11±15.601）

利用建立的胰岛素抵抗模型，本研究探讨了一种新的脂肪因子——Apelin，借此探讨其在胰岛素抵抗中的变化。Apelin是Tatemoto等［2］发现的一种脂肪因子，Apelin由APLN基因编码，人类的APLN基因位于染色体Xq25⁃26［5］，它的基因产物是一种含有77个氨基酸的多肽原随后裂解翻译形成多种激活型包含长度为36、17、13和12的残基［2］。不同长度的Apelin片段与受体的结合能力不同，因此发挥的生理作用也不尽相同。有研究认为，Apelin通过细胞膜上的两种G蛋白（Gi⁃、Gq⁃）［6］、单磷酸腺苷活化蛋白激酶介导的信号通路［7］及磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸⁃苏氨酸蛋白激酶［8］途径来增加周围组织的葡萄糖摄取并增加胰岛素敏感性。目前对于糖尿病患者血浆Apelin水平的改变结论不一，有研究者［9，10］认为经治2型糖尿病患者血浆 Apelin水平升高；Erdem等［11］认为新诊断2型糖尿病患者血浆Apelin水平下降。本研究结果显示HF组大鼠血清Apelin水平均明显高于NC组（P＆lt;0.01）。相关性分析显示血清Apelin与基础胰岛素、FFA、附睾脂肪质量指数均呈正相关。提示在胰岛素抵抗状态下已有Apelin的代偿性分泌增加，表明Apelin可能与胰岛素抵抗相关，通过复杂机制增加葡萄糖摄取及胰岛素敏感性。

综上所述，Apelin作为一种脂肪因子，可能通过复杂机制参与调节肥胖及胰岛素抵抗等病理生理过程，肥胖的胰岛素抵抗大鼠血清Apelin水平明显升高。目前对于Apelin与胰岛素抵抗、肥胖及2型糖尿病的关系尚存在争议，需要进行更多的探讨和研究。

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