葛根素对血管性痴呆大鼠颞叶沉默信息调节因子3表达及细胞凋亡的影响

常明则， 吴海琴， 乔 琳， 狄政莉， 王新来， 田 晔， 刘 勇

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是各种脑血管病引起的一种慢性、阶梯式进展、获得性智能损害和认知障碍的综合征。VD在欧洲和美国等国家是仅次于阿尔茨海默病的第二位最常见的痴呆原因，发病率在发达国家占全部痴呆患者的25% ～50%［1］。沉默信息调节因子3(silent information regulation 2 homolog 3，SIRT3)是一种线粒体NAD依赖的去乙酰化酶，在能量生成、代谢、细胞凋亡和细胞内信号控制功能方面发挥重要作用［2］。葛根素是中药葛根中的有效成分，是一种异黄酮单体。本课题组前期研究已表明葛根素对全脑缺血再灌注大鼠及慢性脑缺血大鼠学习记忆障碍有改善作用［3，4］。目前葛根素对慢性脑缺血保护作用的机制仍不明确。本实验以双侧颈总动脉结扎慢性缺血致VD大鼠为模型，观察葛根素对VD大鼠颞叶组织SIRT3、细胞凋亡及行为学变化的影响，探讨其在改善认知功能中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 健康SD(Sprague-Dawley)大鼠48只，雌雄不拘，体重200～250 g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供;实验前将动物置于实验室适应环境1 w，自由进食、饮水。经Y型水迷宫实验初步筛选后，按随机数字表分为3大组:假手术组、2-VO组和葛根素组，每组再根据缺血时间［血管分离暴露(阻断)至开胸灌注的时间］随机分为2个亚组:4和8 w组，每亚组各8只。假手术组、2-VO组及葛根素组分别选取缺血4、8 w 2个时间点的大鼠于处死前测定学习记忆能力。

1.2 药品和试剂 葛根素注射液(2 ml:100 mg，陕西安康制药厂提供，批号:H61020589);兔抗大鼠SIRT3单克隆抗体:Santa Cruz公司，POD凋亡试剂盒及SABC试剂盒:购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 动物模型的建立 慢性脑低灌注模型的制作参照de la Torre等采用的双侧颈总动脉永久性阻断法(2-VO)进行［5］。20% 水合氯醛 0.6 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，取颈前部正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，套以1号手术线双重结扎，逐层缝合。手术期间严密观察呼吸变化。葛根素组:于术前3 d至术后1 w每天给予葛根素注射液100 mg/kg腹腔注射，手术当天于结扎前1 h给药;2-VO组:该组于相同的时间点分别给予等量生理盐水腹腔注射，余条件同葛根素组;假手术组:该组大鼠仅分离暴露双侧颈总动脉而不结扎。

1.4 学习记忆的测定 应用Y型水迷宫实验进行大鼠学习记忆能力的评估，参照课题组方法［4］，每只大鼠于测试当天共游迷宫10次，测定学习成绩;24 h后重复上述过程测定记忆成绩。术后4 w及8 w 2个时间点的大鼠均于处死前再次行Y型水迷宫实验测定学习记忆成绩。

1.5 标本制备和检测方法 选取双侧颈总动脉结扎后4、8 w 2个时间点，以20%水合氯醛0.8 ml/kg腹腔内注射麻醉大鼠，快速开胸暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，用4%多聚甲醛灌注固定1 h，开颅取脑，置于相同灌注液12 h，取颞叶脑组织依次脱水、透明、浸蜡及包埋，行5μm厚的连续切片。分别进行SABC法SIRT3免疫组化染色及TUNEN法检测细胞凋亡，其中SIRT3免疫组化染色过程中未行苏木素核染色。在40×10倍光镜下随机选择5个视野，做TUNEL阳性细胞、SIRT3阳性细胞计数，以“个/视野”为单位，结果取5个视野的平均值。

1.6 统计学方法 实验数据用SPSS18.0软件包处理，所有数据以均数±标准差(χ±s)表示，组间比较用单因方差分析，SNK-q检验做两两比较，并应用Correlate进行相关性分析。取P＜0.05为显著性标准。

2 结果

2.1 学习记忆能力检测 双侧颈总动脉结扎4 w组大鼠死亡3只，各组大鼠数目:假手术组8只，2-VO组7只，葛根素组6只;双侧颈总动脉结扎8 w组大鼠死亡5只，各组大鼠数目:假手术组7只，2-VO组6只，葛根素组6只。缺血4 w及8 w时，与假手术组相比，2-VO组和葛根素组的大鼠学习记忆成绩均明显下降(P均＜0.05)，但葛根素组在4 w及8 w 2个时间点学习记忆成绩均较2-VO组有明显提高(P均＜0.05)(见表1、表2)。

2.2 细胞凋亡测定 光镜下阳性细胞呈棕黄色，而阴性细胞呈淡蓝色。假手术组颞叶偶见TUNEL阳性细胞，大鼠双侧颈总动脉永久结扎后4 w 2-VO组与葛根素组颞叶TUNEL阳性细胞数显著增多(P均＜0.05)，8 w时TUNEL阳性细胞数仍明显多于假手术组(P均＜0.05)。在4 w和8 w时相点葛根素组大鼠TUNEL阳性细胞数均显著少于2-VO组(P 均 ＜0.05)(见表3、表4)。

2.3 SIRT3表达 假手术组颞叶皮质区可见少量SIRT3阳性细胞数表达。大鼠双侧颈总动脉永久结扎后4 w 2-VO组与葛根素组颞叶SIRT3呈强阳性表达，镜下观察呈颗粒状，以胞膜染色为主，主要位于Ⅱ、Ⅲ层;持续到8 w时仍明显高于假手术组(P均＜0.05);与2-VO组比较，葛根素组SIRT3阳性细胞数显著增多(P均＜0.05)(见表3、表4)。

表1 4 w时不同实验组大鼠的学习记忆成绩(χ±s)

表2 8 w时不同实验组大鼠的学习记忆成绩(χ±s)

表3 4 w时不同实验组大鼠的SIRT3及TUNEL阳性细胞数(χ±s)

χ±s)表4 8 w时不同实验组大鼠的SIRT3及TUNEL阳性细胞数(

2.4 SIRT3阳性细胞数与凋亡细胞的关系 对2-VO组及葛根素组颞叶的SIRT3阳性细胞数与凋亡细胞数做相关分析表明:2-VO组SIRT3与TUNEL阳性细胞数在 4、8 w呈负相关(r=-0.809，P=0.028)(r=-0.893，P=0.017);葛根素组 SIRT3与TUNEL阳性细胞数在4、8 w呈负相关(r=-0.968，P=0.001)(r=-0.866，P=0.026)。

3 讨论

关于SIRT3在脑缺血病理生理过程的研究迄今为止鲜有报道。去乙酰化酶sirtuins通过对广泛的转录因子进行去乙酰化等修饰参与基因沉默、DNA双链断裂修复、组蛋白去乙酰化、细胞周期调节、能量代谢和抗衰老等重要的生命过程。颞叶病变患者主要临床表现为人格、情感和行为改变以及言语障碍，早期人际交往能力下降，表现为不遵循社会行为规范，脱抑制;后期出现空间定向力和记忆力受损，因此推测颞叶受累在血管性痴呆发病过程中极为重要。本研究拟评价葛根素对大鼠VD模型颞叶SIRT3表达及细胞凋亡的影响，探讨其改善VD学习记忆障碍的可能机制。结果表明，VD大鼠颞叶皮层SIRT3表达上调，提示慢性脑缺血缺氧可能诱导颞叶皮层区SIRT3;而葛根素干预可能通过上调SIRT3减轻颞叶皮层细胞凋亡，从而改善VD大鼠学习记忆能力。

生物膜渐进性损伤是慢性脑缺血病理生理过程中的重要环节，线粒体氧化应激过程导致细胞骨架严重破坏，干扰细胞能量代谢，参与微循环障碍、血管内皮细胞损伤及血脑屏障破坏等一系列病理生理过程。SIRT3是sirtuin家族中的重要一员，在调控线粒体能量代谢过程中具有重要的作用。SIRT3依赖SOD2减少细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，降低线粒体膜电位，增强细胞的呼吸作用，调节线粒体功能，增强细胞膜稳定性及抗氧化活性，抑制细胞凋亡进程，进而发挥神经保护作用。SIRT3是调节线粒体ROS代谢通路的枢纽［6～8］。在体外培养条件下，sirtuin抑制剂导致细胞内ROS水平提高，抗氧化剂和低氧刺激均可恢复这种效应。这些与线粒体能量代谢有关的效应可被RNA干扰敲除SIRT3的实验，以及白藜芦醇防护过氧化氢对心肌细胞氧化损伤与激活 SIRT1、SIRT3、SIRT4和SIRT7从而产生抗凋亡作用的实验所证实［9］。研究发现，在缺血应激等某些特殊条件下，SIRT3可以脱离线粒体入核［10］。线粒体通过多种途径参与脑缺血后神经元损伤过程，SIRT3可能通过干预包括生成过量的活性氧造成细胞氧化应激损伤以及膜完整性破坏影响生物活性物质释放等病理机制，抑制内源性及外源性细胞凋亡的部分通路。

我们推测，葛根素可能通过促进SIRT3表达上调和锰超氧化物歧化酶的表达减少、刺激环腺苷酸反应元件结合蛋白磷酸化和上调过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子表达，减少ROS的生成，抑制细胞凋亡进程，进而发挥神经保护作用。本研究中对SIRT3阳性细胞数与凋亡细胞计数的相关分析结果表明，SIRT3阳性细胞数与凋亡细胞计数呈负相关，即随着SIRT3阳性细胞数增多，TUNEL阳性细胞数呈现下降趋势，间接印证了SIRT3可能参与慢性脑缺血后抗细胞凋亡的保护机制。

本实验首次证实了葛根素减轻VD大鼠学习记忆损害机制可能与诱导上调颞叶SIRT3蛋白表达和抗凋亡有关，为临床使用SIRT3激活剂治疗VD提供了部分实验依据，也间接推测葛根素作为中药制剂可能为SIRT3天然激动剂。然而，SIRT3在脑缺血病理生理中的具体作用、葛根素如何启动SIRT3表达及SIRT3参与抗凋亡的具体分子机制仍有待于进一步深入研究。

［1］Brayne C，Stephan BC，Matthews FE.A European perspective on population studies of dementia［J］.Alzheimer’s Dement，2011，7(1):3-9.

［2］Bellizzi D，Covello G，Di Cianni F，et al.Identification of GATA2 and AP-1 Activator elements within the enhancer VNTR occurring in intron 5 of the human SIRT3 gene［J］.Mol Cells，2009，28(2):87-92.

［3］吴海琴，常明则，张桂莲，等.葛根素对大鼠全脑缺血再灌注后学习记忆障碍保护作用及其机制的研究［J］.中风与神经疾病杂志，2004，21(4):350-352.

［4］吴海琴，张 蓓，张桂莲，等.葛根素对血管性痴呆大鼠海马中低氧诱导因子-1A和红细胞生成素表达的影响［J］.西安交通大学学报(医学版)，2006，27(2):132-136.

［5］de la Torre JC，Fortin T，Park GA，et al.Chronic cerebrovaseularinsufficiency induces dementia-like deficits in aged rats［J］.Brain Res，1992，582(2):186-195.

［6］Qiu X，Brown K，Hirschey MD，et al.Calorie restriction reduces oxidative stress by SIRT3-mediated SOD2 activation［J］.Cell Metab，2010，12(6):662-667.

［7］Giralt A，Villarroya F.SIRT3，a pivotal actor in mitochondrial functions:metabolism，cell death and aging［J］.Biochem J，2012，444(1):1-10.

［8］Kim HS，Patel K，Muldoon-Jacobs K，et al.SIRT3 is a mitochondria-localized tumor suppressor required for maintenance of mitoehondrial integrity and metabolism during stress［J］.Cancer Cell，2010，17(1):41-52.

［9］Yu W，Fu YC，Zhou XH，et al.Effects of resveratrol on H2O2-induced apoptosis and expression of SIRTs in H9c2 cells［J］.JCell Biochem，2009，107(4):741-747.

［10］Nakamura Y，Ogura M，Tanaka D，et al.Localization of mouse mitochondrial SIRT proteins:shift of SIRT3 to nucleus by co-expression with SIRT5［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，366(1):174-179.