去铁酮对大鼠脑出血后三价铁转运体及神经功能的影响

尹永锋， 王改青， 陈艳丽

铁离子是脑出血后血红蛋白的降解产物，可增强氧化应激、促进脂质过氧化、损伤DNA和蛋白质，在脑水肿形成、继发性脑损害中起关键作用［1，2］。目前对脑出血的实验干预多采用去铁胺［3～5］，经胃肠吸收差，不能口服，而本实验采用分子量更小、亲脂性高、血脑屏障透过率更好的去铁酮［6］，以减少药物不能及时到达病灶、发挥最大疗效对实验的影响。去铁酮是口服的铁螯合剂，可特异性的结合三价铁，促进其从体内排出［6］。目前国内外关于去铁酮干预脑出血后三价铁相关转运体变化的研究报道较少。本实验旨在观察去铁酮干预大鼠脑出血后铁蛋白(Ft)、转铁蛋白(Tf)和转铁蛋白受体(TfR)的表达变化及神经功能障碍的动态变化。

1 材料与方法

1.1 模型制备 选择健康成年SD大鼠72只，雌雄各半，体重250～300 g，随机分为假手术对照组(SH)、脑出血组(ICH)、去铁酮组(DFP)，每组再分1 d、3 d、7 d、14 d 4 个亚组，每亚组6 只。采用大鼠Ⅳ型胶原酶(美国sigma)定位注射制造脑出血模型。大鼠称重后以10%水合氯醛按300 mg/kg体重腹腔注射麻醉后俯卧位固定于脑立体定位仪(WDT-V型，中国产)，使大鼠前后囟位于同一水平面，备皮、消毒、暴露前囟，于前囟右侧旁开3.2 mm，前囟后1.2 mm处用骨钻钻一直径约1 mm的小孔，用微量泵及微量注射器(上海高鸽)取配好的2.5 μl含0.5 UⅣ型胶原酶的溶液，于5 min注射于苍白球(前囟后 1.2 mm 右侧旁开 3.2 mm，深 5.6 mm)，注射完毕后留针15 min缓慢退出，无菌骨蜡封闭圆孔，缝合皮肤后消毒。SH组步骤相同，注入等量生理盐水。术后24 h按Rosenberg评分法大于10分或断头取脑证实有血肿者入选实验［7］。未到各预定时间点死亡者或到时间点断头取脑未见血肿者剔除实验，重新造模补足实验数量。DFP组于术后24 h Dfp(加拿大奥贝泰克)灌胃125 mg/kg/次，1次/12 h(Q12 h)，SH组与ICH组术后24 h给予等量的生理盐水灌胃Q12 h。

1.2 神经功能评分 各组大鼠造模后正常饮食，按预定时间点根据Rosenberg评分法［7］进行评分。

1.3 免疫组化染色 应用兔抗Ft、Tf、TFR多克隆抗体(武汉博士德，稀释比例1:150)、SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德)。将石蜡标本切片常规脱蜡入水，用新鲜配制的3%H2O2液处理10 min，PBS洗5 min，3次，切片浸入0.01 mol枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)，电磁炉加热至沸腾后断电，冷却至室温后，PBS洗3次，加山羊血清封闭液(武汉博士德)，室温20 min，甩去多余液体，滴加一抗，37℃孵育2 h;PBS洗5 min，3次;加生物素标记的羊抗兔IgG(武汉博士德)，37 ℃孵育30 min，PBS 洗5 min，3 次;加 SABC，37℃孵育30 min，PBS洗5 min，3次;DAB显色，苏木素复染，脱水透明、封片。光学显微镜下观察。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，包括正态性检验、方差齐性检验、LSD多重比较检验、Dunnett’s T3多重比较检验，数据均采用均数 ±标准差(χ±s)表示，显著性水平 α =0.05。

2 结果

2.1 神经功能评分 与SH组比，ICH组、DFP组各时间点均增高，ICH组以1 d最高，3 d、7 d与1 d比差异无统计学意义，于14 d有所下降，DFP组以1 d、3 d最高，之后逐渐下降，于14 d仍高于SH组，DFP组与同时间点ICH组比差异无统计学意义(见表1)。

2.2 Ft免疫组化 SH组比，ICH组Ft免疫阳性细胞数于1 d无明显变化，于3 d、7、14 d增多，以7 d最多;DFP组Ft免疫阳性细胞数也于3 d、7 d、14 d增多，变化趋势相同，但增幅较ICH组小(见表2)。镜下显示Ft阳性细胞主要表达于血肿周围的神经元、神经胶质细胞胞质中。

2.3 Tf免疫组化 与SH组比较，ICH组Tf免疫阳性细胞数于 1 d、3 d、7 d、14 d 增多，以 3 d 最多，7 d次之;DFP组Tf免疫阳性细胞数也于各时间点增高，但升高程度均低于ICH组(见表3)。镜下显示Tf阳性细胞多见于血肿周围少突胶质细胞胞浆或胞核内。

2.4 TfR免疫组化 与SH比较，ICH组 TfR免疫阳性细胞数于1 d天开始增高，3 d、7 d达高峰，于14 d降至对照组水平;DFP组变化趋势与之相同，但各时间点表达量均比ICH组少(见表4)。镜下显示TfR阳性细胞主要表达于血肿周围的神经元和脉络丛内皮细胞胞膜和胞浆。χ±s)

表1 不同组别、不同时间点大鼠神经功能评分(n=6，χ±s，单位:分)

表2 不同组别、不同时间点血肿周围Ft免疫阳性细胞数(n=6，χ±s)

表3 不同组别、不同时间点血肿周围Tf免疫阳性细胞数(n=6，χ±s)

表4 不同组别、不同时间点血肿周围TfR免疫阳性细胞数(n=6，

3 讨论

正常情况下，体内铁在Ft、Tf、Tfr等作用下处于生理稳态，发挥其生理作用［8，9］。脑出血后脑组织内铁离子大量聚集参与了早期的脑损伤，可导致后期神经系统变性［3，10～12］，故对铁离子的有效清除是改善预后重要的手段之一。Dfp是三价铁螯合剂，巩泉泉［6］等发现去铁酮在大鼠脑和睾丸中均可测出，说明其穿透力极强，可通过血脑屏障，有利于对脑组织内铁离子的有效清除。

脑组织将超过生理需要的铁以Ft的形式储存于神经元内，避免过多的铁离子对自身组织的损害。研究表明［3，10］:Tf-Tfr通路是铁通过毛细血管内皮的主要通路。本实验显示ICH组Ft主要表达于血肿周围的神经元细胞中，于3 d开始升高，7 d达高峰，到14 d仍高于正常;而Tf主要表达于血肿周围的少突胶质细胞中，Tfr主要表达于血肿周围的神经元和脉络丛细胞中，两者均从1 d开始升高，3～7 d达高峰，后逐渐下降。可以推断脑出血后大量铁离子的产生破坏了机体原有的铁平衡状态，机体为维持自身平衡而激活Fe-Tf-TfR通路，促进铁离子的外排，另一方面将其转变为Ft储存起来。Zhang、Jing等发现脑出血后有从脑跨过血脑屏障进入血液的Tf，提示 Tf、TfR 可 能 参 与 铁 超 载 的 清 除［13，14］。Jimin Wu［10］等发现Ft的上调是由铁介导的，脑出血后Ft、Tf、TfR的上调有可能起神经保护作用。

Dfp干预脑出血后，F、Tf、TfR的表达量较ICH组虽有所下降，但仍远远高于SH组，提示Dfp可能通过及时有效的结合三价铁减轻了机体的铁负荷，进而减轻了自身诱发维持铁平衡机制的力度，但DFP组的神经功能评分与同时间点ICH组比并无改善。铁主要通过Fenton反应产生活性氧激发氧化压力，引起组织脂质过氧化、蛋白质氧化及DNA的破坏［15，16］。Fenton 反 应:Fe2++H2O2→ Fe3++OH-+OH-，脑出血后二价铁是主要蓄积形式。其原因可能是Dfp有效的结合Fe3+使其减少，促进了该反应的进行，导致活性氧的形成增加从而抵消了清除Fe3+而带来的益处。Auriat、Warkentin 等人［4，5］的研究也表明三价铁螯合剂可降低总铁含量但不能改善神经功能障碍。

此外，在实验之初，Dfp剂量为400 mg/kg/次，大鼠在干预1 d即开始出现血尿、鼻腔出血、精神萎靡，3 d左右相继死亡，改为200 mg/kg/次，上述症状稍有改观，但仍于5 d左右相继死亡，改为125 mg/kg/次后尚能完成实验。由此可见，Dfp的毒性过大限制了其使用剂量。本实验大鼠的神经功能评分未能改善也许有一部分原因可归咎于药物使用剂量偏少。

总之，Dfp可降低脑出血后Ft、Tf、TfR表达上调的程度，不能改善神经功能障碍，而脑出血后自身Ft、Tf、TfR的表达上调可能起神经保护作用。使用二价铁螯合剂也许可以在清除铁超载的同时不促进Fenton反应进行以减少活性氧的产生，这也许是改善脑出血预后的一个新的研究方向。

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