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依达拉奉对大鼠延髓缺血后神经元神经胶质细胞及微血管的影响

2014-11-17高燕军赵淑敏杨振军

中风与神经疾病杂志 2014年2期
关键词:延髓微血管达拉

朱 江, 郭 森, 赵 亮, 高燕军, 赵淑敏, 杨振军

脑缺血后脑组织中自由基的过度产生导致的蛋白质及核酸的过氧化,是导致神经元、血管内皮细胞凋亡的主要因素。在脑缺血条件诱导下,延髓内部微血管、神经元、神经胶质细胞之间存在相互影响。依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮,MCI-186)作为自由基清除剂近年来被研究者关注。临床研究提示N-乙酰门冬氨酸(NAA)是特异性的存活神经细胞的标志,脑缺血发病初期含量急剧减少。本实验将依达拉奉应用于实验模型中,利用其清除自由基,抑制脂质过氧化的药理作用,探讨自由基清除剂对大鼠延髓缺血神经元、神经胶质细胞及微血管的保护作用。

1 材料和方法

1.1 动物与分组 SPF级Wistar成年健康雄性大鼠,200~220 g,购于河北医科大学实验动物中心。108只大鼠随机分为3组:假手术组,实验组,缺血对照组。按时间点分为7 d、14 d两个亚组,其中电镜组每组6只,其余每个亚组12只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 延髓缺血模型制备 结扎右侧颈总动脉:10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg),仰卧固定,颈部正中切口,钝性分离胸锁乳突肌,暴露分离出右侧颈总动脉并结扎切断,检查无活动性出血后,用生理盐水和青霉素(1×105U/L)冲洗后缝合伤口。电凝椎动脉:大鼠俯卧固定,于后正中线第一颈椎水平处作纵形切口,沿中线分开肌层,暴露第1颈椎横突孔,将高频电刀的电凝刀头插入横突孔内凝闭椎动脉3~4 s,检查无活动性出血后,用生理盐水和青霉素(1×105U/L)冲洗后缝合伤口。待清醒后,单笼保温喂养。

1.2.2 实验动物的干预方法 假手术组只暴露双侧椎动脉及右侧颈总动脉,不做血管阻断处理。实验组、缺血对照组均在阻断双侧椎动脉及右侧颈总动脉后立即开始治疗。实验组每天腹腔注射依达拉奉二次,时间间隔12 h,每次注射计量按3 mg/kg计算,到术后7 d和14 d两个时间点分别处死,取延髓。缺血对照组每天腹腔注射生理盐水两次,时间间隔12 h,注射剂量为0.5 ml/次。到术后7 d和14 d两个时间点分别处死,取延髓。

1.2.3 实验标本制作 应用10%水合氯醛(350 mg/kg),腹腔注射。仰卧位固定于鼠板上,快速剪开腹腔和胸腔的前壁,清晰的暴露出心脏,用连有输液管的预先处理为钝圆的针头插入左心室内,快速输入温生理盐水(37℃)100 ml,同时用眼科剪剪破右心耳,此时血液由右心耳处流出,待大鼠四肢末端变白,换上4%多聚甲醛(0.1 mol磷酸盐缓冲液配成pH 7.4)灌流固定。灌流结束后取出延髓,用冰生理盐水冲洗,除去血液。石蜡包埋切片。

1.2.4 电镜标本的制作 将取得的标本切成1 ×1 ×1 mm3的小块,25%戊二醛固定4h,0.1 mol/L的PBS冲洗3次,每次5 min,1%锇酸固定1.5 h,0.1 mol/L的 PBS漂洗 12 h,丙酮梯度脱水,Epon812浸透包埋,超薄切片,铀铅染色。

1.2.5 神经元、神经胶质细胞的细胞计数及定量分析 每只大鼠取4张切片,每张切片在200倍光镜下随机选取5个视野,输入医学显微图像分析系统(MiVnt)进行图像处理,计数神经元、神经胶质细胞,取其平均值为这只大鼠的神经元、神经胶质细胞的细胞数。

1.2.6 单宁酸-氯化铁媒染法观察微血管密度的变化 每只大鼠取3张切片,采用Mivnt图像分析系统定量分析延髓微血管密度(microvesser density,MVD)和微血管面积比(microvesser aera density,MVA)。每张切片在100倍光镜下选5个视野,分别计算MVD值和MVA值,取平均值作为该只大鼠延髓微血管的MVD值和MVA值。

1.2.7 统计学处理 用SPSS13.0统计软件包处理,数据用均数±标准差(χ±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脑组织中神经元数量的变化 通过对7 d、14 d后实验动物的观察,实验组及缺血对照组中神经元的数量较假手术组明显减少。同时,实验组神经元减少的幅度较缺血对照组减少的幅度低。实验组中神经元数量较缺血对照组数量增加。与假手术组相比较有统计学差异(见表1)。

2.2 各组脑组织中神经胶质细胞数量的变化通过对7 d、14 d后实验动物的观察,实验组及缺血对照组中神经胶质细胞的数量较假手术组显著增加。但是,实验组神经胶质细胞增加的程度低于缺血对照组神经胶质细胞增加的程度。其中,实验组各时段神经胶质细胞数量均低于缺血对照组数量。与假手术组比较有统计学差异(见表2)。

2.3 各组脑组织中微血管密度(MVD)和微血管面积比(MVA)的变化 通过对7 d、14 d后实验动物的观察,实验组及缺血对照组的微血管密度(MVD)值较假手术组均减少。实验组数值减少的幅度低于缺血对照组。其中,实验组MVD值在各时段均高于缺血对照组。实验组及缺血对照组的微血管面积比(MVA)值均低于假手术组。实验组数值减少的程度较缺血对照组低。其中,实验组MVA值在各时间段均高于缺血对照组。与假手术组相比较二者均有统计学差异(见表3、表4)。

2.4 各组脑组织中组织学观察 在假手术组中,神经元胞体中央有大而圆的细胞核,核仁大而明显,胞体的细胞质内含有发达的粗面内质网、游离核糖体、高尔基复合体等。粗面内质网呈规则平行排列。游离核糖体分布于其间。神经元尼氏体丰富。线粒体膜完整,线粒体嵴清晰。神经胶质细胞有序排列在神经元周围。微血管内皮相互连续,基膜完整。缺血对照组实验7 d时,可观察到神经元数量减少,核固缩、碎裂、溶解,膜结构模糊。细胞核内有核袋及假包涵体形成。核仁偏位,核膜内陷。线粒体体积较前增大,质地变空,线粒体嵴变短。粗面内质网脱颗粒。神经胶质细胞数量较前增加,排列紧密,核仁明显。微血管闭塞,数量减少,膜结构不清晰。实验14 d时可观察到,神经元数量较前进一步减少,神经元溶解消失,细胞器破坏明显。神经胶质细胞增加明显,细胞较大,核较小。微血管数量较前有所增加。实验组中神经元数量较缺血对照组数量多,核固缩、破裂、溶解的程度较缺血对照组程度轻。实验组较缺血对照组坏死区域面积小,且局部填充的胶质细胞数量少。实验组中微血管闭塞数量较缺血对照组少,血管内皮肿胀程度低,膜结构较清晰。

表1 各组大鼠脑组织中神经元数量比较(χ±s)

表2 各组大鼠脑组织中神经胶质细胞数量比较(χ±s)

表3 各组大鼠脑组织中MVD含量的比较(χ±s)

表4 各组大鼠脑组织中MVA含量比较(χ±s)

3 讨论

延髓内部包含大量神经元,神经元周围有神经胶质细胞填充。正常生理情况下,神经元、神经胶质细胞和毛细血管紧密结合在一起[1]。延髓中有大量神经纤维通过,是联系大脑、小脑、脊髓的生命中枢,因此,研究延髓缺血具有其重要性、必要性。

在延髓缺血后,出现神经元数量及微血管密度的减少,神经胶质细胞数量的增加。在缺血条件下,神经胶质细胞大量增生填充于坏死区域,从而影响到微循环,引起局部微循环障碍。进一步加重神经元的缺血,出现大量神经元胞体凋亡。自由基在脑缺血缺氧损伤过程中起着关键性作用,自由基对脑组织的损害是通过和缺血缺氧脑损害级联反应机制中的兴奋性氨基酸、钙超载等彼此重叠、相互联系的作用使脂质过氧化、膜功能损害、蛋白质、DNA、RNA损害最终形成炎症、凋亡等病理过程实现的[2]。目前认为脑缺血后氧自由基增多是脑损伤加重的主要原因,依达拉奉作为一种新型自由基清除剂,抑制脂质过氧化作用、抑制脑细胞过氧化,从而减轻脑缺血引起的组织损伤[3],也能防止氧化性细胞损伤,减少缺血半暗带面积,可减轻血管内皮细胞损害[4],从而抑制迟发性神经元凋亡[5]。为脑缺血损伤提供保护作用[6]。研究表明,依达拉奉有直接清除NO、羟自由基及抗氧化活性作用[7]。同时依达拉奉可减少神经元NO合成酶和增加内皮型NO合酶,从而保护缺血损伤的神经元[8]。

通过本实验结果可见,实验组延髓组织的神经元减少的数量低于缺血对照组,提示依达拉奉可通过清除自由基而保护神经元。实验组神经胶质细胞增加的数量较缺血对照组数量低,实验组中延髓组织内微血管密度较缺血对照组高。说明依达拉奉在延髓缺血过程中通过清除自由基,减轻了脑组织损伤。随着时间的延长,尽管应用依达拉奉干预治疗,但神经元数量仍在减少,神经胶质细胞数量仍有增加。考虑依达拉奉可减轻内源性自由基的产生,提示在治疗上应尽早用药。

本实验结果提示,延髓缺血后由于自由基产生,使延髓内部微血管、神经元、神经胶质细胞相互影响,出现病灶局部微循环改变,出现迟发性神经元死亡,缺血脑组织损伤加重。依达拉奉通过清除自由基,减轻血管内皮细胞损害,改善了微循环障碍,发挥了对神经细胞的保护作用。

[1]刘斌主编.组织学与胚胎学[M].北京:北京大学出版社,2003.12-25.

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