Numb蛋白对α-synuclein蛋白寡泛素化水平的调控

王 跃， 丁雪冰， 王雪晶，2， 张雯雯， 荆 婧， 马耀华， 滕军放，2

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常见的中枢神经系统变性疾病之一，其主要病理变化为黒质-多巴胺系统受损使多巴胺神经元大量减少，导致运动迟缓、肌强直、震颤等锥体外系症状出现。α-突出核蛋白(α-synuclein，α-syn)是一种在脑组织中含量丰富的小蛋白质，尤其在神经元细胞浆高表达，相对分子质量为18～20 kD，α-syn蛋白发生部分折叠并相互作用形成寡聚体，α-syn寡聚体聚积产生细胞毒性导致神经元变性与PD的发生、发展有密切的联系［1］。Numb基因是首个被发现的决定细胞不对称分裂的基因，通过Numb/Notch途径在生物的神经发育中发挥着重要作用。Numb蛋白与Notch蛋白通过相互拮抗作用调控UPS，参与某些蛋白的的泛素化修饰［2］。目前，国内外关于Numb蛋白对α-syn蛋白寡泛素化水平调控的研究尚未见报道。本研究通过检测Numb与α-syn的相互作用，旨在深入探求Numb蛋白对α-syn寡泛素化水平的调控及诱导α-syn包涵体形成的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)为中南大学湘雅医院唐北沙教授馈赠，EGFP-N1、EGFP-Numb、HA-α-synuclein 为苏州大学王光辉教授馈赠。ProteinG购于罗氏公司，DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购于美国GIBCO公司，转染试剂脂质体LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 SH-SY5Y细胞培养于含15%FBS的DMEM完全培养液中，置于37℃、5%CO2细胞孵育箱中培养。质粒转染步骤参考脂质体LipofectamineTM2000说明书进行。

1.2.2 细胞免疫荧光检测Numb蛋白和α-syn蛋白的亚细胞共定位 将转染后的SH-SY5Y细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，然后用1×PBS洗涤2次后加入4%的多聚甲醛，室温下固定10 min，再用1×PBS洗涤3次，加入0.25%的TritonX-100/PBS透化10 min，经1×PBS洗涤后，加入一抗α-FLAO/PBST室温下孵育2 h，经1×PBST洗涤3次后加入二抗 α-mouse-Rho/PBST室温避光1h，再经1×PBST洗涤3次后，加入Hochest于室温下避光孵育3 min复染细胞核，经1×PBST洗涤3次后用荧光显微镜观察，并在400倍视野下，在各组细胞随机抽取3个以上不相重复的视野观察拍照。

1.2.3 免疫共沉淀 转染24 h后，加入10 μmol/L MG132处理，24 h后收集细胞，经细胞裂解液裂解后于冰上放置10 min，4℃下12000r/min离心25 min后收集上清，取40μl上清加入等体积Loading buffer 100℃煮沸10 min，4℃保存。其余上清用于免疫共沉淀实验。取40μl Protein G分别加入30μl 5%BSA、700μl PBS以及4μl相应抗体，4℃ 孵育6 h，洗涤沉淀3次，加入上述剩余上清液4℃ 过夜。次日，冰上震荡2 h，反复洗涤8次。去上清加入等体积Loading buffer 100℃煮沸7 min。离心取上清进行Western-blot检测。

1.2.4 Western-blot检测 取 10 μl上清进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，将分离后的蛋白转移到硝酸纤维滤膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h后，在1×TBST中洗涤3次，加入相应一抗，4℃ 孵育过夜。次日，用1×TBST洗膜3次后加入相应的二抗，室温下在摇床上孵育2 h，洗膜后加入ECL试剂，暗室内X胶片曝光显影。

1.2.5 细胞免疫荧光检测 α-syn包涵体 将SH-SY5Y细胞以4×105/ml接种于六孔板里，取对数生长期细胞，加入终浓度为1 mmol/L的MPP+处理36 h，分别将EGFP-N1或EGFP-Numb转染SHSY5Y细胞，转染24 h后经4%的多聚甲醛固定、0.25%的TritonX-100/PBS透化，经1×PBS洗涤后，加入一抗 α-FLAO/PBST室温下孵育2 h，经1×PBST洗涤3次后加入二抗α-mouse-Rho/PBST室温避光1 h，再经1×PBST洗涤3次后，加入Hochest于室温下避光孵育3 min染细胞核，经1×PBST洗涤3次后用荧光显微镜观察，在荧光显微镜下随机选择3个以上视野进行观察。

2 实验结果

2.1 Numb蛋白与α-syn蛋白的亚细胞共定位

细胞免疫荧光结果显示，将EGFP-Numb与HA-αsyn共同转染SH-SY5Y细胞，可见HA-α-syn呈核周分布，EGFP-Numb呈全细胞分布，核膜周围较明显，Numb蛋白与α-syn蛋白在SH-SY5Y细胞中存在亚细胞共定(见图1)。

2.2 Numb蛋白与α-syn的结合 分别将EGFP-N1或EGFP-Numb与HA-α-syn共同转染后进行免疫共沉淀，经Western-blot分析，结果显示，与EGFP-N1组对比，过表达EGFP-Numb组的沉降复合物中可检测到α-syn蛋白的存在，表明Numb蛋白与α-syn蛋白相互结合(见图2)。

2.3 Numb上调α-syn寡泛素化水平 分别将EGFP-N1或EGFP-Numb与HA-α-syn共同转染，24 h后加MG132处理。转染36 h后收集细胞裂解液，用anti-HA抗体进行免疫沉淀后、用anti-Ub检测αsyn泛素化水平。Western-blot检测结果显示，与EGFP-N1组相比，EGFP-Numb组的α-syn寡泛素化水平明显上调(见图3)。

2.4 Numb诱导MPP+细胞模型中α-syn包涵体的形成 细胞免疫荧光结果显示，在MPP+细胞模型中，与 EGFP-N1组相比，EGFP-Numb组中 αsyn包涵体增多。这表明Numb促进MPP+诱导的α-syn包涵体形成(见图4)。

图1 SH-SY5Y细胞中Numb与α-synuclein的亚细胞共定位1-A中红色标记α-syn表达;1-B绿色标记Numb表达;1-C蓝色标记细胞核;1-D中箭头所指Numb与α-syn共定位

图2 Numb与α-syn相互结合。过表达EGFP-Numb的沉降复合物检测到α-syn蛋白

图3 Numb蛋白促使α-syn蛋白的寡泛素化水平上调

图4 Numb蛋白促进MPP+诱导的α-syn包涵体形成。与EGFP-N1组对照，过表达Numb的MPP+细胞模型中α-syn包涵体增多(箭头所指)(scale bar=20μm)

3 讨论

α-synuclein蛋白是由140个氨基酸构成的小分子蛋白质，在大脑皮层、海马、杏仁核和嗅球含量丰富，多集中于神经元突触前末梢、核膜及细胞质中。其生理功能尚不清楚，可能与突触的可塑性、神经递质的传递及高尔基、内质网的转运网络有关。作为帕金森病病理特征的Lewy小体中含有丰富的纤维化的 α-syn蛋白［3］。有研究发现，在 α-syn纤维化的过程中形成的初原纤维化的α-syn及寡聚体具有细胞毒性，而α-syn寡聚体细胞毒性更强，致使多巴胺神经元损伤，参与帕金森病的病理过程［4，5］。

泛素是一种含有多个赖氨酸残基的小分子蛋白质，其功能包括参与细胞的分裂、生长、细胞间的信号传导、细胞凋亡等。这些功能都是通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)实现的。蛋白质的泛素化修饰包括多聚泛素化和寡泛素化修饰两种修饰方式，某些膜蛋白和可溶性蛋白可被单泛素或寡泛素修饰［6］，寡泛素化修饰参与蛋白折叠的调节、胞浆运输以及胞吞过程［7］。Lee等人研究发现Siah-1可与 α-syn蛋白相互结合，促进 α-syn寡泛素化修饰［8，9］。王雪晶等研究发现BAG5通过调节帕金森相关Pakin蛋白抑制α-syn泛素化降解，促使 α-syn聚集体增多［10］。Crews等人发现α-syn蛋白通过调控Notch1水平参与了鼠神经细胞发生过程［11］。

Numb是一种进化上保守的膜相关蛋白，是细胞不对称分裂的决定因子，其在神经系统及成熟的组织中广泛存在。Numb与多种信号通路关系密切，如Notch、WNT等信号通路，其中Numb/Notch信号通路在细胞增殖分化、神经系统发育、肿瘤的生成等方面研究较多。Susini等人发现Siah-1蛋白与Numb蛋白相互结合，并因而促进Numb蛋白通过泛素-蛋白酶体系统降解［12］。

Numb蛋白通过UPS调节p53的降解，参与了乳腺癌的病理过程［13］。Chan SL等人研究发现Numb蛋白通过抑制细胞内钙离子释放参与了AD发病过程，从而为Numb参与神经系统退行性疾病的病理过程提供了理论依据［14］。Schmit等研究发现Numb与tubulin存在亚细胞共定位，Numb与Tubulin相互作用致使 tubulin表达上调［15］，Chen L及Esteves AR等人研究发现tubulin与α-syn存在共定位，在体外实验中Tubulin可促使α-syn寡聚体积聚，诱导 α-syn 包涵体形成［15，16］。由此推测，Numb可能与α-syn相互作用诱导α-syn包涵体形成从而参与帕金森病的病理过程。

1-甲基4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyr-idium，MPP+)是神经毒素 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)经B型单胺氧化酶氧化生成的活性物质。MPP+被多巴胺能神经元摄取后可抑制线粒体复合物I的功能，损伤线粒体，导致多巴胺能神经元的变性死亡，产生类似PD的临床表现及病理变化。SH-SY5Y细胞源于人的神经母细胞瘤SK-NSH细胞系［17］，具有神经突样的细胞质突起，表达多巴胺羟化酶和多巴胺转运体及酪氨酸羟化酶，该细胞系被广泛运用于PD发病机制的研究。MPTP的代谢产物MPP+作用于SH-SY5Y细胞可以作为研究PD发病机制的体外细胞模型。

在我们研究中，为探求Numb蛋白与α-syn蛋白的泛素化调控，首先利用细胞免疫荧光技术检测Numb与α-syn蛋白的共定位，结果显示二者存在亚细胞共定位。由于蛋白间存在复杂的相互作用，为进一步验证Numb与α-syn的相互作用，我们分别将EGFP-N1或EGFP与HA-α-syn共同转染后利用免疫共沉淀技术及Western-blot检测，结果发现在过表达Numb的沉淀复合物中检测到α-syn蛋白的存在，因此，可证实二者存在相互结合。之后，进一步研究Numb对α-syn寡泛素水平的调控，结果显示，EGFP-Numb与HA-α-syn共同转染后，通过Western blot检测证实Numb上调了α-syn寡泛素化水平。最后，构建MPP+细胞模型，分别将EGFP-N1、EGFPNumb转染SH-SY5Y细胞，利用细胞免疫荧光技术检测内源性α-syn包涵体。结果显示，与EGFP-N1组对比，EGFP-Numb组中过表达的 Numb促使MPP+诱导的α-syn包涵体的形成。

综上所述，Numb蛋白上调α-syn蛋白的寡泛素化水平，并参与诱导α-syn包涵体的形成。这将可能有助于我们寻找阻断Lewy小体形成的新的干预靶点，为帕金森病的早期治疗提供新的手段。

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