脂联素基因多态性(-11377 C/G，-3964A/G，-45T/G)与脑梗死相关性研究

相 波， 丁晓洁， 张 磊， 王 超， 王晓青， 潘旭东

脂联素(Adiponectin，ADIPOQ)是由脂肪组织特异性分泌的激素蛋白，参与能量代谢、维持血糖、血脂平衡。它具有胰岛素超敏化作用，能改善胰岛素抵抗［1］;参与炎症反应具有抗动脉粥样硬化作用。在急性脑梗死发生后的全部病程中ADIPOQ均具有脑保护作用:超早期可抑制ROS产生减少应激损伤［2］;发病早期可抑制炎症因子 TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1和黏附分子VCAM-1/ICAM-1的生成减轻缺血后炎症反应［3，4］;修复期可保护血管内皮功能，促进缺血组织血管内皮生长因子(VEGF)的表达以刺激血管新生［5］，同时可诱导缺血组织血管内皮eNOS磷酸化，增加血管中NO含量，能扩张血管、增加脑血流量、促进缺血脑组织功能恢复。动物实验及临床研究均证实血浆ADIPOQ水平与脑梗死相关［3，6］。

脑梗死是遗传和环境因素共同作用的多基因疾病，实现在人类全基因组范围内进行关联分析从而确定脑梗死的主要致病基因，现阶段仍需继续探求与脑梗死关联的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)数目。研究提示ADIPOQ基因也是脑梗死易感性的候选基因之一［7］，ADIPOQ基因变异与ADIPOQ水平相关［8］。但是此基因与脑梗死相关性的研究较少而且研究结果不一致，目前尚无关于ADIPOQ基因多态性与脑梗死易感性的Meta分析。我们在中国北方青岛地区汉族人群中进行ADIPOQ基因多态性与脑梗死发病病因的相关性研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象 (1)脑梗死组:均为2011年3月～2013年1月在青岛大学医学院第二附属医院神经内科就诊的脑梗死患者，共372例，其中男性182例，女性190例。入组标准:诊断标准符合中华神经科学会第四届全国脑血管病会议修订的“各类脑血管疾病诊断要点(1995)”。入选病例均经头部CT和(或)MRI证实，并且行经颅多普勒、颅脑血管超声、头部MRA、心脏超声检查，部分患者进一步行CTA、DSA等检查明确脑血管和心脏病变情况。排除标准:①严重心、肝、肾功能不全;②心源性栓塞、其他病因或不明原因型脑梗死;③继发性脑梗死，如严重感染、脑血管畸形/动脉瘤、血栓性疾病、肿瘤、血液病、自身免疫性疾病等。(2)对照组:为同期查体中心的查体者416例，其中男性216例，女性200例，其性别与年龄与脑梗死组相匹配。入组标准:既往无脑梗死病史，头部CT或MRI证实无脑梗死灶。排除标准:同病例组。

1.2 临床数据采集 所有入组者均填写调查问卷，内容包括研究对象的一般情况(如:姓名、性别、年龄等)、家族史、既往史、吸烟及饮酒史。该研究符合我院所制订的伦理学标准，所有入组者均签署知情同意书。测量血压、身高、体重、抽取晨起空腹血检测生化指标

1.3 SNPs的选择 从NCBI的SNP数据库中选取ADIPOQ基因多态性位点，要求所选位点异型性已知，且其相对少见的等位基因频率在亚洲人群中＞0.05，最终选择 3个代表性的 SNPs即rs266729、rs822396及rs2241766进行检测。

1.4 基因多态性检测 所有受试者均于清晨空腹抽取前臂静脉血5 ml，EDTA抗凝，常温下2700 rpm/min离心10 min，收集细胞层，冻存于-80℃冰箱待用。应用血液基因组快速抽提试剂盒(上海生工SK8224)提取DNA。rs266729和rs2241766采用PCR-RFLP鉴定基因多态性(PCR扩增引物和限制性内切酶见表1)，分别鉴定出rs266729的3种基因型CC、CG、GG和rs2241766的3种基因型 TT、TG、GG。PCR总反应体系10μl:DNA模板100 ng，5 U/μl Taq DNA 扩增酶(上海生工 SK2492)0.1 μl，10×PCR Buffer 1 μl，2 mmol/L dNTP Mix 0.8 μl，25 mmol/L MgCl21μl，上、下游引物各1 μl(2 μmol/μl，上海生工合成)，加双蒸水至10μl。PCR反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后，取3μl PCR产物经琼脂糖电泳鉴定，剩余7μl PCR产物分别用限制性内切酶HhaI酶(Thermo scientific ER1851)和 SmaI酶(Thermo scientific ER0661)过夜消化，电泳观察(150 V 20 min)。随机抽取部分标本经测序(上海生工完成)鉴定rs266729和rs2241766的基因型，测序结果与PCR-RFLP结果完全相符。rs822396位点因未找到天然内切酶，采用直接测序法分析(上海生工完成)，鉴定出AA、AG及GG 3种基因型。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差(χ±s)表示，两组计量资料比较采用以t检验;计数资料比较采用χ2检验;多因素logistic回归分析进行ADIPOQ基因多态性与脑梗死的相关性研究，P＜0.05有统计学意义。SESsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)进行基因分析，基因型和等位基因风险率采用相对危险度(odds ratio，OR)表示;用Hardy-Weinberg平衡检验确定样本是否具有群体代表性。

2 结果

2.1 脑梗死组和对照组一般临床资料比较脑梗死组和对照组比较，年龄、性别、饮酒史、总胆固醇、低密度脂蛋白水平无统计学差异(P＞0.05);BMI(≥24 kg/m2)、吸烟史、收缩压、舒张压、甘油三酯、高密度脂蛋白、空腹血糖水平有统计学意义(P＜0.05)(见表 2)。

2.2 等位基因频率及基因型分布的比较 3个SNP的基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。rs266729的基因型分布在脑梗死组和对照组中有统计学差异(P＜0.05);rs822396、rs2241766的基因型分布在脑梗死组和对照组中无统计学差异(P＞0.0 5);上述3个SNP的基因频率在脑梗死组和对照组中无统计学差异(P＞0.05)(见表3)。

2.3 rs266729与脑梗死的相关性 进一步在显性、隐性、累加这3种模式下分析rs266729与脑梗死的相关性。在3种模式下，rs266729的基因型分布在脑梗死组和对照组中有统计学差异(P＜0.05);rs266729 G等位基因变异能增加脑梗死的易感性(3种模式下 OR 值分别为:1.35、2.15、2.33)(见表4)。

2.4 多因素logistic回归分析 调整脑梗死危险因素BMI(≥24 kg/m2)、吸烟史、收缩压、舒张压、甘油三酯、高密度脂蛋白、空腹血糖水平后，多因素logistic回归分析结果示显性模式下rs266729的基因型分布在脑梗死组和对照组中仍有统计学差异(P＜0.05)，GG+GC基因型可增加脑梗死的易感性(OR值=1.44)，G等位基因变异仍是脑梗死的易感危险因素(见表5)。

2.5 单倍型分析 3个SNP位点采用SESsis在线软件(http://analysisbio-x.cn/myAnalysis.php)进行连锁不平衡分析，未发现存在连锁不平衡。单倍型频率均＜0.03。

表1 鉴定rs266729和rs2241766位点的PCR引物及限制性内切酶

表2 研究对象一般临床资料分析

表3 ADIPOQ基因3个SNP的基因频率及基因型分布

表4 rs266729与脑梗死的相关性

表5 rs266729与脑梗死相关性的多因素Logistic回归分析

3 讨论

ADIPOQ基因位于染色体3q27上，全长约17 kb，含3个外显子和2个内含子［9］。大量研究发现染色体3q27区域能增加2型糖尿病、代谢综合征及心血管病变的遗传易感性［10～12］，但是关于此区域与脑梗死发病易感性关系的研究较少。因此，我们进一步研究位于此区域的ADIPOQ基因多态性与脑梗死发病的相关性。

本研究发现rs266729在显性、隐性、累加模式下均与脑梗死有相关性;在调整脑梗死的危险因素BMI(≥24 kg/m2)、吸烟史、收缩压、甘油三酯、高密度脂蛋白、空腹血糖水平后，多因素logistic回归分析仍表明在显性模式下rs266729与脑梗死具有相关性;GG+GC基因型可增加脑梗死的易感性;等位基因G变异是脑梗死易感的危险因素。刘芳等［13］认为rs266729 GG基因型和G等位基因可增加中国北方汉族人群脑梗死的风险性;陈小良等［14］发现虽然rs266729与北方汉族总体人群脑梗死易感性无关，但在女性中GG纯合变异增加了脑梗死的易感性。同样，Yamada等［15］发现rs266729 GG基因型能增加日本人群中代谢综合征患者动脉粥样硬化性脑梗死的风险。

上述针对亚洲人群的研究与本研究结果一致;但是针对美国人群的研究结果却相反，Hegener HH［7］等发现rs266729能降低脑梗死的危险性，这提示rs266729微小等位基因G变异可能具有种族差异性。

rs266729位于ADIPOQ基因启动子区域，研究发现其等位基因G与低血浆ADIPOQ水平相关［16］。在3T3-L1大鼠脂肪细胞中发现，等位基因G能改变DNA结合活性从而降低ADIPOQ基因启动子的活性［17］;同时研究发现G基因也能降低转录因子sp1和启动子结合位点的亲和性［18］。上述因素可引起ADIPOQ基因表达减少，从而导致血浆ADIPOQ水平减少。低血浆ADIPOQ水平与脑梗死相关［6］，因此rs266729等位基因G变异能增加脑梗死的易感性。

rs822396位于第2个内含子区域，Pischon等［19］发现rs822396 G基因与美国女性非致命性心肌梗死或致命性冠脉血管病变相关。My-Young Cheong等［20］研究表明在韩国人群中此位点与脑梗死相关，而且包含 rs822396在内的由 6个 SNP(rs822396、rs822391、rs182052、rs16861205、rs12495941、rs3776241)组成的单倍型(AGGCGG and AAGTAG)与脑卒中相关。Hegener HH等［7］针对美国人群研究发现由rs266729/rs182052/rs822396组成的单倍型(GAG)与降低缺血性卒中相关。国内尚未发现rs822396与脑梗死相关性的研究报告，本研究首次发现rs822396在显性、隐性、累加模式下均与脑梗死无相关性。

rs2241766位于第二个外显子区域，等位基因G/T变异为同义变异(GGT-GGG，Gly-Gly)。目前有关于此位点的研究较多，但结果差别较明显。陈小良等［14］研究认为rs2241766基因多态性与中国北方汉族总体人群脑梗死的易感性相关;但刘芳等［13］针对中国北方人群及Hegener HH等［7］针对美国人群的研究结果却显示rs2241766与脑梗死不相关，这与本研究的结果一致。同样，不同学者关于rs2241766与冠脉血管病变、糖尿病及高血压病的易感性的研究结果也不一致［21］。

同连锁分析相比，关联分析的结果会受到研究人群的遗传背景、实验设计、样本大小、研究对象的入选标准等多因素影响，因此有必要针对不同种族、不同区域的人群进行关联性研究。

目前我们仅在美国［7］、亚洲［13～15，21］人群中发现的这几项关于ADIPOQ基因多态性与脑梗死易感性的研究，结果也不一致。虽然尚不清楚ADIPOQ基因确切的遗传模式，但本研究确实发现rs266729 G等位基因变异与增加脑梗死发病易感性相关。我们下一步希望重点选取位于连锁不平衡区域内的SNP位点及扩大样本进行研究，同时继续深入探讨ADIPOQ基因多态性与脑梗死发病易感性相关的机制。

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