丹红注射液延迟缺氧性呼吸抑制的发生及其机制

李 丽， 刘文彦， 刘 莹

正常的呼吸节律和幅度是维持生命体稳态的必要条件，同时，当生命体内环境中各种理化因素发生变化时，呼吸也会有相应的变化。缺氧是调节呼吸的一种常见的化学因素，轻、中度的缺氧可刺激外周化学感受器引起呼吸兴奋，但重度的缺氧往往可以直接损害呼吸中枢神经元，引起呼吸抑制，甚至死亡［1］。所以，寻求对抗缺氧性呼吸抑制的药物有重要意义。丹红注射液是由丹参和红花两味中药按科学配方提取的复方中药制剂，具有扩张脑血管、增加脑血流量、抑制血小板聚集和脂质过氧化损伤、促进缺氧后大鼠轴突功能再生、修复各种迟发型神经元损伤、加速神经功能恢复等作用［2］。因此我们推测，丹红注射液可能抵抗呼吸中枢神经元的缺氧性损伤，进而对呼吸抑制起到保护作用。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)属于非电压门控的对Na+有通透性的离子通道，由胞外酸化所激活，在外周和中枢神经系统广泛表达。ASIC1a是ASICs的一种亚型，当pH值小于6.9而不是远低于正常pH时，ASIC1a即可被激活［3］。缺氧时，细胞无氧糖酵解增强，组织酸化，ASIC1a易被激活。已有研究表明，缺氧时ASIC1a表达明显增加，且缺氧的程度与ASIC1a的表达呈正相关，预孵育ASIC1a特异阻断剂psalmotoxin 1可以减轻体外缺血缺氧引起的神经元损伤［4］。以上研究结果提示ASIC1a参与了缺氧性损害这一病理过程。因此，在本研究中，首先以膈肌肌电为呼吸指标，观察丹红注射液对大鼠的缺氧性呼吸抑制有无保护作用;其次，采用免疫组织化学的方法，在缺氧大鼠脑干，检测丹红注射液对ASIC1a表达的影响，以期探讨其缺氧保护作用的相关机制。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 实验选用健康成年SD大鼠共24只，雌雄不限，体重250～300 g，由山东大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 丹红注射液购自菏泽步长制药有限公司;ASIC1a抗体和免疫组化染色试剂盒均购自上海彩佑实业有限公司。

2 方法

2.1 丹红注射液缺氧性呼吸抑制保护作用的观察健康成年SD大鼠24只随机分为4组，即空气对照组、单纯缺氧组、缺氧加丹红组和单纯丹红组。动物经20%乌拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠固定在手术台上，颈部气管插管，切断双侧迷走神经，于剑突下打开腹腔并暴露膈肌，并在膈肌上找到合适位置连接电极，以膈肌肌电记录呼吸运动的变化。手术完成待其恢复30 min开始观察。对于空气对照组动物，从气管插管侧管通入流量为200 mL/min的空气;对单纯缺氧组动物，向其气管插管侧管通入相同流量的纯N2;对缺氧加丹红组动物，除向其气管插管侧管内通入相同流量的纯N2外，在麻醉前30 min和缺氧前30 min(手术完成后)分别腹腔注射丹红注射液(10 mL/kg);对单纯丹红组动物，除向气管插管侧管通入相同流量的空气外，其余同缺氧加丹红组。所有动物自通入气体前10 min开始，以每10 min为1个间隔，记录1次膈肌肌电，每次记录1 min。膈肌肌电呼吸的变化以吸气时程(inspiratory time，TI)、呼气时程(expiratory time，TE)、呼吸频率(respiratory frequency，RF)和吸气幅度(amplitude of inspiration，Amp)为指标经BL-420生物机能实验系统进行观察和分析。

2.2 ASIC1a表达的检测 我们的研究资料表明，在本实验条件下，缺氧30 min时，动物呼吸出现明显抑制，因此，我们选择通入气体30 min为取材时间。动物经左心室插管，先后经生理盐水和40 g/L多聚甲醛溶液各250 mL灌流固定脑组织;取脑干于40 g/L多聚甲醛溶液后固定8 h;200 g/L蔗糖磷酸缓冲液中过夜至脑干下沉;液氮冷冻;恒温冰冻切片机从延髓尾端至脑桥头端连续冠状切片(片厚40 μm);每6张切片取1张并进行ASIC1a免疫组化染色。

切片处理如下:PBS(0.01 mol/L，pH 7.4，下同)漂洗3 min×3次;Triton X-100 37℃孵育30 min，PBS漂洗3 min×3次;30 mL/L过氧化氢孵育20 min，蒸馏水漂洗3 min×2次，PBS漂洗3 min×3次;滴加封闭用正常羊血清，37℃孵育1 h;滴加兔抗鼠ASIC1a抗体(1∶100)，37 ℃孵育 2 h，4 ℃过夜，PBS漂洗3 min×3次;滴加生物素标记羊抗兔IgG，37℃孵育2 h，PBS漂洗3 min×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育2 h，PBS漂洗3 min×3次;DAB室温显色，PBS漂洗2次终止反应;裱片;晾干后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。

利用HPIAS-1000高清病理图文报告分析系统细胞测量程序测定脑干ASIC1a阳性神经核团免疫组化染色的灰度值及阳性神经元个数。对于每张切片的某个神经核团，随机取5个高倍视野测定其灰度值，此例动物所取切片该核团的平均灰度值即为该例动物该核团的灰度值。在每张切片的某个核团，取5个不重叠的视野计数其阳性神经元个数，此例动物所取切片该核团的阳性神经元个数之和除以所取切片数即为该核团的阳性神经元个数。

3 统计学处理

数据以均数 ±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS分析软件，组间均数比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 丹红注射液对缺氧性呼吸效应的影响

对空气对照组和单纯丹红组动物，吸入空气前后呼吸无明显变化(P＞0.05)。对单纯缺氧组动物，缺氧即刻、缺氧后第10 min和20 min较缺氧前的TI和TE明显缩短，RF明显增快，Amp明显增大(P＜0.05)，即呼吸明显兴奋。缺氧后30 min较缺氧前的TI明显变短，TE明显延长，RF明显减慢，AMP明显减小(P＜0.05)，即呼吸出现明显的抑制。与单纯缺氧组相比，缺氧加丹红组在缺氧即刻及缺氧后第10 min、20 min呼吸的变化如同单纯缺氧组，但缺氧后30 min较缺氧前TI明显缩短，TE明显延长，RF明显增快(P＜0.05)，Amp与缺氧前相比无显著变化(P＞0.05)，即在缺氧后30 min呼吸尚未出现明显抑制，见图1、表1。

Figure 1.Effect of Danhong injection on the respiratory inhibition induced by hypoxia in the rats of hypoxia group(A)and hypoxia plus Danhong group(B).图1 丹红注射液对缺氧性呼吸抑制的影响

表1 丹红注射液对缺氧性呼吸抑制的作用Table 1.Effect of Danhong injection on respiratory inhibition induced by hypoxia(Mean±SD)

2 丹红注射液对缺氧大鼠脑干ASIC1a表达的影响

空气对照组、单纯丹红组、单纯缺氧组和缺氧加丹红组脑干均有ASIC1a的表达，表达的核团主要位于孤束核和斜方体核。空气对照组和单纯丹红组孤束核和斜方体核ASIC1a的表达无明显差异(P＞0.05)。与空气对照组和单纯丹红组相比，单纯缺氧组和缺氧加丹红组在斜方体核和孤束核的ASIC1a阳性神经元着色的深度明显加深，灰度值明显降低，即ASIC1a的表达明显增强(P＜0.05)，但 ASIC1a阳性神经元的个数未见明显增加(P＞0.05)。与单纯缺氧组相比，缺氧加丹红组ASIC1a阳性神经元的着色深度明显变浅，灰度值明显增加，即ASIC1a的表达明显减少(P＜0.05)，但ASIC1a阳性神经元的个数未见明显减少(P＞0.05)，见图2、表2。

表2 丹红注射液对缺氧大鼠斜方体核和孤束核ASIC1a表达的影响Table 2.Effect of Danhong injection on the expression of ASIC1a in the nuclei of trapezoid body and solitary tract(Mean±SD)

讨 论

1 丹红注射液对缺氧性呼吸抑制的作用

在本研究中，大鼠对缺氧的呼吸效应为先兴奋后抑制，低氧引起的呼吸兴奋完全是通过刺激颈动脉体和主动脉体外周化学感受器来实现的，因为将颈动脉体和主动脉体的传入神经切断后，低氧所致的呼吸兴奋效应则消失。同时，低氧可损伤呼吸中枢神经元，进而引起呼吸抑制，当低氧对呼吸中枢的直接抑制作用大于刺激外周化学感受器引起的呼吸兴奋效应时，呼吸则表现为抑制。缺氧可通过能量耗竭、酸中毒、兴奋性氨基酸、钙超载、自由基、炎症细胞因子等多种因素对呼吸中枢神经元造成损伤［5］，进而引起呼吸抑制。丹红注射液主要成分为丹参酮、丹参素、红花黄素、红花酮苷等。研究发现，丹参酮和丹参素具有降低脂质过氧化物损伤、稳定生物膜、提高超氧化物歧化酶活性、抗自由基损伤等作用;红花黄素和红花酮苷具有减轻兴奋性氨基酸、钙超载及炎症细胞因子对细胞的损伤等功能［6］。因此，丹红注射液能明显减轻缺氧对神经元的损伤。在我们的研究中，丹红注射液能延迟缺氧性呼吸抑制的产生，延缓缺氧性呼吸抑制的发生，可能与上述提到的减轻神经元缺氧性损害的作用有关。

2 丹红注射液延缓缺氧性呼吸抑制发生的机制

缺氧时，由于乳酸堆积和ATP水解产生H+，导致组织酸化，进而诱导 ASIC1a的开放，引起大量Na+内流，导致细胞水肿，同时ASIC1a对Ca2+也有较大通透性，加重细胞内钙超载，引起神经元坏死，因此，ASIC1a是非谷氨酸依赖性钙毒性神经元损伤的主要参与者［7］。当低氧等各种化学性刺激激活外周化学感受器时，冲动沿传入纤维首先到达脑干孤束核，经多级神经元的传递来调节通气量［8］。因此，孤束核在缺氧所致的呼吸兴奋效应中发挥着重要作用。李丽等［9］、李自成等［10］的研究发现，缺氧大鼠出现呼吸抑制时，斜方体核的Fos蛋白和神经元型一氧化氮合酶表达明显增强，提示斜方体核也是参与缺氧性呼吸调节的重要核团。我们在研究中发现，缺氧后孤束核及斜方体核的ASIC1a表达明显增加，即孤束核及斜方体核神经元缺氧性损伤较严重，这可能是造成缺氧性呼吸抑制的重要原因，而丹红注射液能明显降低孤束核和斜方体核ASIC1a的表达，减轻神经元的缺氧性损伤，因此，丹红注射液能延迟缺氧性呼吸抑制的产生，进而保护机体免受缺氧性呼吸抑制的损伤。

综上所述，丹红注射液能明显延迟缺氧性呼吸抑制的发生。丹红注射液能明显降低缺氧后孤束核和斜方体核ASIC1a的表达，因此丹红注射液延迟缺氧性呼吸抑制发生的机制可能与ASIC1a有关。

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