高效液相色谱法测定上清丸中大黄酸大黄素大黄酚的含量

廖杨玲

【摘要】目的：建立以HPLC法测定上清丸中大黄酸、大黄素、大黄酚含量的方法。方法：采用Symmetry C18柱，以甲醇-0.1%磷酸=80:20为流动相，检测波长：430nm，流速1.0mL?min-1，柱温:室温。结果：大黄酸、大黄素、大黄酚分别在7.92～79.2ng（r=0.9998）、14.5～145ng（r=0.9991）、27.24～272.4ng（r=0.9994）线性关系良好，平均加样回收率分别为99.7%、99.2%、99.4%，RSD分别为0.95%、1.25%、1.27%。结论：本方法操作简便、灵敏度高、重现性好，适用于上清丸中大黄酸、大黄素和大黄酚的含量测定。

【关键词】高效液相色谱法；上清丸； 大黄酸、大黄素、大黄酚

【Abstract】Objective: To establish a HPLC for determination of rhein、emodin、chrysophanol in Shangqing Pills. Method: A Symmetry C18 Column was used. The mobile phase was methanol-0.1% Phosphoric Acid =80:20， the detecting wavelength was at 430nm，the flow rate was 1.0mL?min-1，the column temperature was room temperature. Result: The linear relationship of rhein、emodin、chrysophanol were 7.92～79.2ng（r=0.9998）、14.5～145ng（r=0.9991）、27.24～272.4ng（r=0.9994）, the recoveries were 99.7%, 99.2%, and 99.4%,respectively, the RSD were 0.95%, 1.25%, and 1.27%,respectively. Conclusion: This method was easy and simple to handle, has good repeatability, flexibility and high sensitivity. It can be used for the determination of rhein、emodin、chrysophanol in Shangqing pills.

【key words 】HPLC; Shangqing pills; rhein; emodin; chrysophanol

【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)07-0007-01

上清丸由菊花、白芷、黄芩、黄柏等12味药而制成的大蜜丸，收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第十册》，具有清热散风、解毒、通便等功效，对头晕耳鸣、目赤、鼻窦炎、通便等有很好的作用［1］。目前的标准中只有丸剂的通则检查，尚无定性定量指标，而目前的文献报道主要对其方中的大黄、黄柏进行定性鉴别［2］，或者对黄芩苷［2］、小檗碱［3］进行含量控制，但为了有效控制质量，我们认为控制方中主药大黄中的大黄酸、大黄素和大黄酚的含量更有意义。我们查阅相关文献［4－9］并改进，采用高效液相色谱法测定上清丸中大黄酸、大黄素和大黄酚的含量，现报道如下。

1.仪器与试药

美国Waters高效液相色谱仪（1525二元泵，2487双通道检测器，717自动进样器，Empower色谱工作站）；色谱柱：Symmetry C18（4.6mm×150mm，5μm）。SG3300HP超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）； KQ3000超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；WX-80A微型旋涡混合仪（上海沪西仪器有限公司）；BT25S电子天平（精度0.01mg，德国赛多利斯科学仪器有限公司）；FA1104电子天平（精度0.1mg，上海舜宇恒平仪器有限公司）。

大黄酸对照品（批号：0757-200206）、大黄素对照品（批号：110756-200110）、大黄酚对照品（批号：110796-200412）均购自中国药品生物制品检定所，均为供含量测定用。上清丸产自湖南XX制藥股份有限公司（批号：20120906、20121101、20130305，规格：9克?丸－1）；甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水；其他试剂为分析纯。

2、方法与结果

2.1色谱条件

色谱条件：Symmetry C18（4.6mm×150mm，5μm），流动相：甲醇－0.1%磷酸=80:20；流速：1.0mL?min-1；检测波长：430nm；柱温: 室温；进样量:10μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备分别精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的大黄酸、大黄素、大黄酚对照品4.46、8.25、13.62 mg，分别置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取大黄酸、大黄素、大黄酚对照品储备液各1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含大黄酸、大黄素、大黄酚4.46、7.25、13.62 μg?mL－1的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备取本品20丸，剪碎，取约3g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流1小时，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取5ml，置锥形瓶中，蒸干，残渣加2.5mol/L硫酸溶液10 mL，超声处理（功率300W，频率50kHz）5min，再加三氯甲烷10mL，置水浴上加热回流1h，立即冷却，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取三次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3阴性供试品溶液的制备取缺大黄阴性样品适量，照供试品溶液制备方法制得阴性供试品溶液。

2.3系统适应性试验

按“2.1”项下色谱条件，精密吸取供试品溶液、对照品溶液及阴性样品溶液各10 μL进样，结果大黄酸、大黄素、大黄酚与邻峰基线分离，理论板数按大黄素峰计不低于7000，且其他成分不干扰其测定，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

A.混合对照品，B.样品，C.阴性样品，1.大黄酸，2.大黄素，3.大黄酚

2.4线性关系的考察

精密吸取“2.2.1”项下对照品混合溶液2.0、4.0、6.0、10.0、16.0、20.0μl分别注入高效液相色谱仪测定，记录峰面积，以峰面积（A）为纵座标，以进样量（C）为横座标，绘制标准曲线，大黄酸回归方程为A=3.218×104 C－2.682×103， r=0.9998（n＝6），在7.92～79.2ng呈良好的线性关系；大黄素回归方程为A=2.878×104C－3.042×103，r=0.9991（n＝6），在14.5～145ng呈良好的线性关系；大黄酚回归方程为A=3.588×104 C－1.042×104，r=0.9994（n＝6），在27.24～272.4ng呈良好的线性关系。

2.5精密度试验

取对照品混合溶液在“2.1”项下色谱条件下，每次进样10μL，重复进样6次，大黄酸、大黄素、大黄酚峰面积的RSD值分别为1.2%、0.8%、0.6%。

2.6稳定性试验

取批号20120906的供试品溶液，分别于0、1、3、5、10h分别进样测定，结果5次进样大黄酸峰面积的RSD=1.4%；大黄素峰面积的RSD=0.9%；大黄酚峰面积的RSD=1.2%，结果表明供试品溶液在10h内稳定。

2.7重复性试验

取批号20120906的样品，按“2.2.2”供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，依法测定，大黄酸平均含量为0.2948mg/g，RSD=0.8%；大黄素平均含量为0.4015 mg/g，RSD=1.1%；大黄酚平均含量为0.6700 mg/g，RSD=1.2%，结果表明该方法的重复性好。

2.8回收率试验

取已知含量的样品（批号：20120906，含大黄酸、大黄素、大黄酚分别为0.2948、0.4015、0.6700mg?g-1），剪碎，取约1.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取5mL，分别精密加入混合对照品溶液（含大黄酸、大黄素、大黄酚4.46、7.25、13.62 μg?mL－1）8.0、10.0、12.0mL各3份，按“2.2.2”项下，自“蒸干，残渣加2.5mol/L硫酸溶液10 mL”起，制备供试品溶液，按“2.1”项下测定含量，结果见表1。

表1 回收率试验结果

Tab 1ResultofDetermination of sample recovery (n=3)

2.9样品的测定

取供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，测定3批样品，结果见表2

表2 样品含量测定结果(n=3)

Tab 2ResultofDetermination of rhein、emodin、chrysophanol (n=3)

批号 含量(mg/g) 大黄酸 大黄素 大黄酚20120906 0.2948 0.4015 0.670020121101 0.3102 0.4528 0.732820130305 0.3148 0.4600 0.72823 讨论

3.1测定波长的选择

分别取三种对照品溶液，于200nm～600nm范围内进行扫描，结果三种对照品均在254、285、430nm处有最大吸收，选择254nm作为测定波长，发现杂质在此波长处吸收很强，干扰主成分的测定，而在430nm处杂质吸收弱，杂质干扰小，有利于样品中有效成分的测定，故选定430nm作为检测波长。

3.2 提取溶剂的选择［4］

试验曾选用三氯甲烷和乙醚对样品进行提取，三氯甲烷提取的大黄酸、大黄素和大黄酚的含量远远高于乙醚，故选用三氯甲烷作为提取溶剂。提取2次和提取3次含量无明显差别，故选择提取2次。

3.3回流时间的的考察［5］

为保证样品中样品的结合蒽醌能完全水解为游离蒽醌，用2.5mol/L硫酸溶液对样品的结合总蒽醌进行加热水解，试验了3个不同的水解时间，第一份加热水解0.5h、第二份加热水解1.0h、第三份加热水解1.5h，按上述拟定的供试品溶液制备方法及含量测定项下的条件，依法测定。结果表明，回流提取0.5小时，样品中的大黄素水解不完全，回流提取1.0、1.5h，均可使样品中的大黄素水解完全，因此确定加入2.5mol/L的硫酸溶液10mL与三氯甲烷10ml回流提取时间为1.0h。

3.4 流动相的选择

比较了甲醇与0.1%磷酸的多种不同配比，结果甲醇：0.1%磷酸=80:20，出峰时间适当，峰形好，且大黄酸、大黄素、大黄酚与邻峰基线分离好。

参考文献

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