猪脑心肌炎病毒2B蛋白与RACK1蛋白相互作用的鉴定

2014-09-10崔尚金李江南杨春梅于会彬郭东伟张元峰夏雪山翁长江

中国预防兽医学报 2014年5期

王岩，黄丽, 崔尚金，李江南，杨春梅，于会彬，郭东伟，张元峰，夏雪山，翁长江*

(1.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明 650500；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物病原监测与流行病学研究创新团队，黑龙江哈尔滨 150001）

王岩1,2，黄丽2, 崔尚金2，李江南2，杨春梅2，于会彬2，郭东伟2，张元峰2，夏雪山1*，翁长江2*

为筛选与猪脑心肌炎病毒(EMCV）2B蛋白相互作用的宿主蛋白，本实验利用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞表达文库制备与EMCV 2B蛋白相互作用的宿主蛋白RACK1蛋白。酵母共转化试验和免疫共沉淀试验表明两者可以特异性结合，激光共聚焦试验表明两者共定位于细胞质中。为定位RACK1与2B蛋白相互作用区域，本研究构建了RACK1截短表达重组质粒，并将其与pCAGGS-Flag-2B共转染HEK293细胞，利用免疫共沉淀试验验证其相互作用区域。结果显示2B蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用，并且证明相互作用区域位于RACK1蛋白的N端。

猪脑心肌炎病毒；酵母双杂交；2B蛋白；RACK1蛋白；相互作用

猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV）属于小RNA病毒科，心病毒属，无囊膜单股正链RNA。该病毒主要引起多种哺乳动物发生心肌炎和脑炎等疾病。1958年首次在巴拿马证明EMCV为猪的一种致死性疾病的病原[1]。EMCV基因组长7.8 kb，含有一个大的开放性阅读框(ORF），编码4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4）和7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）[2-3]。其中2B蛋白由326个氨基酸组成，编码产物的分子量为17 ku[4]，含有一个或多个疏水区。2B蛋白可以增加细胞膜的渗透性，这可能对病毒感染晚期病毒粒子的释放具有重要的作用[5]。

本研究以EMCV编码的2B蛋白为“诱饵”，利用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞cDNA的酵母表达文库，发现蛋白激酶C1受体(Receptor of activated protein kinase C1，RACK1）与 EMCV 2B 蛋白能够相互作用。并通过酵母共转化试验、免疫共沉淀(Co-IP）试验和表达蛋白的共定位试验进一步验证了2B和RACK1之间的相互作用，本研究为进一步研究RACK1在EMCV复制和致病机制中的作用奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒、细胞和酵母表达文库E.coliDH5α感受态细胞、重组质粒 pCAGGS-Flag-2B、pCMV-HA-RACK1、 pGBKT7、 pGADT7、 pGBKT7-2B、酵母菌 Y2H、HEK293细胞、BHK细胞，BHK-21细胞酵母表达文库均由本实验室保存。

1.2 主要试剂质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；抗Flag单克隆抗体(MAb）、抗HA MAb、4',6'-二脒基 -2-苯基吲哚(DAPI）、Flag-Beads、羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP均购自Sigma-Aldrich公司；抗Flag和抗HA多克隆抗体购自艾比马特公司；羊抗鼠IgG-FITC、羊抗兔IgG-TRITC均购自北京中山金桥生物技术有限公司；ECL发光检测试剂盒购自Thermo公司。

1.3 诱饵蛋白的自激活试验将pGBKT7-2B与pGADT7空载体共转化感受态Y2H酵母菌，分别在SD/-Ade-Trp(SD/-2）、 SD/-Ade-Trp-Leu-His(SD/-4）及SD/-Ade-Trp-Leu-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A）平板上验证pGBKT7-2B是否有自激活作用。阳性对照质粒为pGBKT7-p53+pGADT7-T，阴性对照质粒为pGBKT7-Lam+pGADT7-T。

1.4 酵母双杂交试验将pGBKT7-2B转化Y2H酵母菌，涂布于SD/-Trp琼脂培养基平板上，挑取形态规则的单菌落接种至SD/-Trp液体培养基，将菌液用SD/-Trp液体培养基重悬，加入BHK-21酵母表达文库杂交；涂布在SD/-4平板上，并将平板上生长的阳性克隆转移至SD/-4/X/A平板上做进一步筛选；得到的阳性克隆进行菌落PCR后测序并比对序列，以确定捕获的宿主蛋白；从阳性酵母菌落中提取捕获蛋白的酵母表达质粒，并转化E.coliDH5α，以提取重组质粒进行酵母共转化试验验证相互作用。

1.5 共转化试验将pGBKT7-2B与pGADT7-RACK1共转化感受态Y2H酵母菌，验证两者间的相互作用，同时设空白对照pGBKT7+pGADT7，阴性对照 pGBKT7+pGADT7-T，阳性对照pGBKT7-p53+pGADT7-T和自激活对照pGBKT7+pGADT7-RACK1。

1.6 真核重组表达质粒的构建以全长pCMVHA-RACK1为模板扩增RACK1截短质粒，引物序列见表1。扩增产物与pCAGGS-HA载体分别EcoRⅠ/KpnⅠ酶切后连接，分别构建重组RACK1截短表达质粒pCAGGS-HA-RACK1-WD1-7、pCAGGSHA-RACK1-WD1-5、 pCAGGS-HA-RACK1-WD1-3、pCAGGS-HA-RACK1-WD2-7、pCAGGS-HA-RACK1-WD6-7。

表1 实验所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.7C o-I P试验将质粒pCAGGS-Flag、pCMVHA-RACK1、pCAGGS-Flag-2B和pCMV-HA分别共转染HEK293细胞，收集细胞样品后裂解细胞并收集细胞裂解液，取出部分加入Flag-beads，剩余部分作对照。Flag-Beads与蛋白孵育后进行western blot检测。

1.8 We s t e r nb l o t检测 Co-IP样品经SDS-PAGE分离后，湿转至PVDF膜上；5%脱脂乳室温封闭，分别以兔抗HA或抗Flag MAb(1∶1 000）为一抗，以羊抗兔IgG-HRP或羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000）作为二抗，通过ECL发光检测。

1.9 激光共聚焦检测将pCAGGS-Flag-1B和pCMV-HA-RACK1共转染HEK293细胞，4%甲醛固定、0.3%Triton X-100透膜、10%的FBS血清封闭；以抗Flag MAb和兔抗HA多抗(1∶100）为一抗，羊抗鼠 IgG-TRITC(1∶100）和羊抗兔 IgG-FITC(1∶100）作为二抗；最后用终浓度为1 mM DAPI孵育，激光共聚焦显微镜下观察。

2 结果

2.1 酵母双杂交筛选与E MC V2 B蛋白相互作用的宿主蛋白将pGBKT7-2B诱饵质粒与pGADT7空载体共转化Y2H酵母菌，结果表明pGBKT7-2B无自激活活性。将pGBKT7-2B诱饵质粒转化Y2H酵母菌，再用Trp缺陷型固体培养基筛选得到阳性克隆与BHK-21酵母表达文库进行杂交，利用SD/-4、SD/-4/X/A培养基平板进行筛选，将阳性克隆进行PCR及测序鉴定，测序结果经序列比对，其中一部分克隆为RACK1编码序列。

2.2 2 B蛋白与R A C K 1蛋白在酵母体系中的相互作用鉴定将pGBKT7-2B和pGBKT7空载体与pGADT7-RACK1共转化至Y2H酵母菌，在SD/-4和SD/-4/X/A均能够生长出阳性克隆并且无自激活活性，阳性对照和阴性对照均成立，表明2B和RACK1存在相互作用关系(图1）。

图1 酵母双杂交实验验证2B蛋白与RACK1蛋白的相互作用Fig.1 Identification of the interaction between 2B and RACK1 by yeast two-hybrid assay

2.3 E MC V2 B蛋白和R A C K 1蛋白在H E K 2 9 3细胞中相互作用鉴定将pCAGGS-Flag-2B、pCMVHA-RACK1、pCAGGS-Flag和pCMV-HA空载体分别转染或共转染HEK293细胞；加入Flag beads与细胞裂解液共孵育。Co-IP样品经western blot分析。结果显示，只有在2B与RACK1共转染的细胞中，2B和RACK1存在特异性的相互作用(图2）。

图2 免疫共沉淀验证2B与RACK1的相互作用Fig.2 Interaction of 2B and RACK1 confirmed by Co-IP

2.4 E MC V2 B蛋白与R A C K 1蛋白共定位利用激光共聚焦方法检测过表达2B和RACK1的细胞共定位。将pCAGGS-Flag-2B和pCMV-HA-RACK1共转染HEK 293细胞，24 h后，转染细胞用一抗和荧光标记的二抗孵育后，利用激光共聚焦显微镜检测2B和RACK1的共定位。结果显示，2B表达在细胞胞质和细胞核中，RACK1表达在细胞胞质中，图像经合并后呈现橙黄色，表明2B和RACK1在细胞胞质内共定位(图3）。

图3 激光共聚焦试验检测2B与RACK1的共定位Fig.3 Co-localization of 2B and RACK1 in the cytoplasma of transfected HEK293 cells under confocal microscopy

2.5 E MC V2 B蛋白和R A C K 1蛋白的相互作用区域鉴定构建5个pCAGGS-HA-RACK1的截短重组表达质粒(图4），将其分别与pCAGGS-Flag-2B共转染HEK293细胞后进行Co-IP处理样品。Western blot检测结果显示，2B蛋白除了和RACK1全长相互作用外还与RACK1的截短区域WD1-5、WD1-3相互结合(图4），表明2B蛋白与RACK1蛋白的N端相互作用。

图4 免疫共沉淀验证2B与RACK1的相互作用区域Fig.4 The minimal domain for the interaction of 2B and RACK1 detected by Co-IP

3 讨论

酵母双杂交是研究蛋白间相互作用最常用的方法之一，可以高通量地筛选与目的蛋白相互作用的蛋白。Co-IP是一种建立在抗原和抗体亲和作用的基础上，研究蛋白质相互作用的方法。本研究以EMCV 2B蛋白作为“诱饵”，从BHK-21 cDNA细胞文库中筛选到与之相互作用的宿主蛋白RACK1，并通过酵母共转化、Co-IP和共定位检测证明两者之间存在相互作用。构建RACK1截短重组质粒：RACK1-WD1-7、 RACK1-WD1-5、 RACK1-WD1-4、RACK1-WD2-7、RACK1-WD6-7。通过 Co-IP验证RACK1与EMCV 2B相互作用区域，WD1-7、WD1-5、WD1-3区域都与2B存在相互作用，通过Co-IP实验验证相互作用区域在N端。

RACK1属于WD40蛋白家族成员，分子量为36 ku[6]，含有7个WD(色氨酸和天冬氨酸）重复基序。这些区域是在异源三聚体G蛋白的β亚基中被第一次鉴定，而异源三聚体G蛋白在蛋白与蛋白相互作用中起到重要作用[7]。1991年，RACK1首次被鉴定为蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC）受体的结合蛋白，RACK1作为一种穿梭蛋白，协同PKC正确定位并发挥生物学功能[8-9]。RACK1能够增强PKC对脑和肌肉组织芳香羟受体核转运蛋白的类似蛋白-1(BMAL1）的磷酸化作用并抑制BMAL1-CLOCK异源二聚体的转录活性[10]，流感病毒的基质蛋白1能够与RACK1相互作用，被PKC磷酸化。本研究表明EMCV 2B蛋白与RACK1蛋白存在相互作用，为进一步研究RACK1在EMCV感染和复制过程中的作用奠定了基础。

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Identification of the interaction between 2B protein of encephalomyocarditis virus and RACK1

WANG Yan1,2,HUANG Li2, CUI Shang-jin2,LI Jiang-nan2,YANG Chun-mei2,YU Hui-bin2,GUO Dong-wei2,ZHANG Yuan-feng2,XIA Xue-shan1*,WENG Chang-jiang2*
(1.College of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China）

To screen the host proteins interacted with the 2B protein of encephalomyocarditis virus(EMCV）,we scanned the BHK-21 expression library using EMCV 2B protein as bait protein by yeast-two-hybrid,and found a potential interacting partner protein of RACK1.The interaction of the 2B and RACK1 proteins was further confirmed by co-transformation in the yeast and Co-IP assay in co-transfected HEK293 cells.In addition,they were co-localized in the cytoplasma of co-transfected HEK293 cells examined by laser confocal assays.To map the interacting domain of RACK1,a series of RACK1 truncated eukaryotic expression recombinant plasmids were construct and co-transfected with pCAGGS-Flag-2B into HEK293 cells,respectively,which were subjected to Co-IP and detected by western blot.The results suggested that EMCV 2B interacted with N terminal of RACK1.

encephalomyocarditis virus;yeast-two-hybrid;2B protein;RACK1 protein;interaction

S852.65

1008-0589(2014）05-0339-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.05.01

*Correspondingauthor

2013-12-20

国家自然科学基金(31300139）；中国农业科学院基本科研业务费预算增量项目(2013ZL034）

王岩(1988-），女，辽宁抚顺人，硕士研究生，主要从事猪脑心肌炎病毒与宿主蛋白相互作用研究.

*通信作者：E-mail：oliverxia2000@yahoo.com.cn；wengchji@163.com

(本文编辑：赵晓岩）