猪源屎肠球菌致病力与耐药性及生物被膜形成能力的相关性分析
2014-09-10卢彩景张秀平王新卫敬文宪常洪涛刘红英姚慧霞王川庆
卢彩景，张秀平，陈 陆，赵 军，王新卫，敬文宪，常洪涛，刘红英，姚慧霞，王川庆，杨 霞
(河南农业大学禽病研究所，河南郑州 450002）
猪源屎肠球菌致病力与耐药性及生物被膜形成能力的相关性分析
卢彩景，张秀平，陈 陆，赵 军，王新卫，敬文宪，常洪涛，刘红英，姚慧霞，王川庆，杨 霞*
(河南农业大学禽病研究所，河南郑州 450002）
为研究猪源屎肠球菌的致病力与耐药性及生物被膜形成能力的相关性，本研究分别对9株猪源屎肠球菌进行动物试验、药敏试验和生物被膜形成能力的测定。结果显示有66.67%的菌株引起小鼠肝脏、脾脏出血等病变，并且其中部分菌株导致接种小鼠急性的高死亡率；9株屎肠球菌中KF-QX-1株耐药率最高为100%，其次 为 ZKXH01(95.24%）、NY01(90.48%）、NY-XY-4(80.95%）、SBLH(76.19%）、HUAX(71.43%）、NY-XY-1(71.43%）和ZHENGY(66.67%），耐药率低于50%的菌株只有JY02(14.29%）；生物被膜检测结果显示9株菌中除NY01株外均有不同程度的的被膜形成能力，其中2株菌(JY02和NY-XY-1）生物被膜形成能力相对较强；通过对上述试验结果综合分析显示，肠球菌菌株对受试动物的致病力与其耐药性和生物被膜形成能力之间缺乏明显的相关性，但具有生物被膜形成及耐药两种特性会增强猪源肠球菌的耐药性和传播性，给人类和动物的疾病控制造成更大的威胁。
肠球菌；致病力；耐药性；生物被膜；相关性
肠球菌(Enterococci）是存在于人和动物胃肠道内的常在菌群，偶尔定植于口腔和阴道，并广泛分布于自然界中，是一种重要的机会致病菌。该菌由于自然寄生于动物的肠道，常被作为一种有益菌进行研究。目前，由于抗生素的大量使用，加上免疫抑制剂的不合理使用等因素，使得肠球菌的感染在医学临床中日趋严重[1-2]，主要表现为尿路感染、败血症、脑膜炎及肺炎等[3]。在兽医临床中近年来也有动物感染的报道[4-6]，肠球菌属在兽医临诊临床样品中的分离率不断增加[7]。
猪源屎肠球菌虽然是健康猪肠道内的正常菌群，但由于抗生素的滥用等因素导致该菌耐药现象日益严重、引起的感染也日益增多，给养猪业造成了很大的经济损失。生物被膜是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象，由微生物及其分泌物积聚而形成。随着近年来对生物被膜研究的深入，人们发现细菌对抗生素的耐药性不仅仅与抗生素不规范使用有关，还与致病菌在体内形成生物被膜有一定程度相关性[8]。本研究的目的是通过对临床猪源屎肠球菌分离株进行致病性试验、耐药性测定及生物被膜形成能力检测，进一步分析猪源屎肠球菌分离株对受试动物的致病力与其耐药性及生物被膜形成能力有无相关性。
1 材料和方法
1.1 菌株及实验动物 9株猪源屎肠球菌分离株均分离自河南各地送检的病猪，菌株编号分别为NY-XY-4、JY02、SBLH、HUAX、ZHENGY、NY01、NY-XY-1、ZKXH01、KF-QX-1，均由河南农业大学传染病教研室分离纯化并于-70℃条件下保存。75只6周龄SPF级昆明实验小鼠购自河南省实验动物中心。
1.2 主要试剂 BactoTMTodd Hewitt Broth(THB）培养基购自BD公司；药敏纸片(共21种）购自杭州天和微生物试剂有限公司；鲜血平板购自河南联博生物科技有限公司。
1.3 致病性试验
1.3.1 细菌培养与计数将冻存的9株猪源屎肠球菌分离株分别划线培养于含5%绵羊血的平板上，37℃培养24 h后，挑取单菌落接种于5 mL含5%胎牛血清的THB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日按1∶100的比例转接于上述新鲜培养基中，37℃振摇培养14 h，经10倍递进稀释在THB琼脂平板上培养进行菌落计数。
1.3.2 绝对致死量及最大全不致死量的测定参照文献[9]的方法，选取1株猪源屎肠球菌NY-XY-4株进行预实验。取小鼠25只，随机分为5组，每组5只，根据计数结果将1～4组分别腹腔注射剂量为：15×109cfu/0.5 mL，7.5×109cfu/0.5 mL，4.5×109cfu/0.5 mL，1.5×109cfu/0.5 mL的PBS重悬菌液各0.5 mL，空白对照组注射PBS 0.5 mL。观察3 d，记录发病与死亡情况。确定其绝对致死量和最大全不致死量。
1.3.3 肠球菌株对小鼠的致病性试验取小鼠50只随机分为10组，将9株屎肠球菌均按上述试验结果选取绝对致死量和最大全不致死量之间的一个细菌剂量分别腹腔接种菌液各0.5 mL。对照组小鼠分别注射0.5 mL PBS。观察3 d，记录各组小鼠的发病和死亡情况及相关病变情况，同时采取每组受试小鼠肝脏接种于THB液体培养基中37℃振摇培养16 h后，镜检观察。
1.4 生物被膜检测试验 猪源肠球菌分离株生物被膜形成能力的定量检测参照文献[10-11]方法，并稍有改动。简要步骤如下：挑取单个菌落接种到5 mL含5%胎牛血清的THB(THB-5%）液体培养基中，37℃，200 r/min培养过夜；次日将该培养物按1∶100转接于 5 mL新鲜 THB-5%培养基中，37℃，200 r/min培养14 h；将上述菌液用THB-5%培养基按1:40倍稀释，取稀释后的菌液200 μL接种到无菌的96孔聚苯乙烯微量板，对照孔加入200 μL培养基，37℃静置培养24 h后，用200 μL PBS缓冲液轻缓的洗涤3次，倒置于37℃温箱中干燥1 h取出，每孔加入 200 μL 1%结晶紫在室温下染色15 min，然后吸出结晶紫并用PBS洗涤至空白对照孔无色或紫色很浅，再加入200 μL 4∶1的乙醇/丙酮于振荡器上振荡10 min溶解结晶紫，吸取溶解液各150 μL于新的孔内用酶标仪测其OD570nm值，以试验测得OD570nm值作为细菌吸附于无机物表面并形成生物被膜能力大小的指标。生物被膜形成量的判定标准：以阴性对照的平均OD570nm加标准差定义为ODc，待测菌株OD与ODc比较，将菌株生物膜形成能力分为 4类：阴性(-）：OD
1.5 药敏试验 采用纸片扩散法，参照文献[12]所述方法进行。
2 结 果
2.1 各菌株的致病性试验
2.1.1 绝对致死量及最大全不致死量的测定结果预实验结果显示猪源屎肠球菌NY-XY-4株绝对致死量约4.5×109cfu/0.5 mL、最大全不致死量约1.5×109cfu/0.5 mL，选取介于二者之间的细菌剂量约3.0×109cfu/0.5 mL作为正式试验的接种剂量。
2.1.2 肠球菌株对小鼠的致病性试验结果在3×109cfu/0.5 mL的接种剂量下，有66.67%的菌株显示出明显的致病力，其中JY02和ZKXH01株接种12 h后逐渐衰竭死亡，并且肝脏、脾脏、肠道均严重充血，肺脏、胃、输卵管及卵巢轻微充血；NY-XY-4株接种24 h后逐渐衰竭死亡，主要表现为肝脏、肠道均严重充血，脾脏、肺脏、胃、输卵管及卵巢轻微充血；其余菌株接种后72 h均未出现死亡，但剖检可见SBLH、NY01、ZHENGY及NYXY-1株接种的小鼠肝脏、脾脏均严重充血，其余器官轻微充血、出血或无可见变化；HUAX和KF-QX-1株致病轻微，剖检后仅见内部脏器轻微出血或无可见变化，具体致病率与死亡率详见表1。
表1 各菌株致病性Table1 The pathogenicity ofEnterococcusstrains
2.1.3 菌株的回收 分别采集每组受试小鼠的肝脏接种于THB液体培养基，37℃恒温培养16 h，结果显示除对照组外，其余各组的接种物均变轻度混浊，革兰氏染色后，经镜检均可看到革兰氏阳性球菌，表明9株菌接种后均可从小鼠体内重新分离到。
2.2 生物被膜形成能力 利用结晶紫染色半定量法对9株猪源肠球菌分离株进行生物被膜形成能力检测，结果显示：9株菌中除NY01株外均有不同程度的的被膜形成能力，其中2株菌(JY02和NY-XY-1）生物被膜形成能力相对较强，3株菌(ZHENGY、KF-QX-1、SBLH）的被膜形成能力次之，其余猪源肠球菌分离株形成能力较弱(图1）。
图1 各菌株生物被膜形成能力Fig.1 The capability of biofilm formation inEnterococcusstrains
2.3 各菌株耐药特点 药敏试验结果表明9株猪源屎肠球菌的耐药率为14.29%～100%，并且均对林可霉素和罗红霉素具有抗性，对其余19种抗生素的耐药性有一定程度的差异(图2）。
图2 各药敏片的耐药菌株比例Fig.2 The rate antibiotic-resistantEnterococciin antibiotics
3 讨 论
本研究中动物试验结果表明，9株猪源屎肠球菌临床分离株均显示出有致病性，其中66.67%的菌株致病力明显，接种后均可引起小鼠内脏器官出现不同程度的病变或死亡，并且从各受试组肝脏中均回收到待测菌株。药敏试验显示，9株菌株中除JY02耐药率稍低(14.29%），其余8株耐药率均较高(66.67%～100%）。虽然从总体趋势上绝大多数高耐药率菌株均具有一定致病力，但个别菌株的耐药率与致病力又不完全呈正相关性，其中耐药率最低的菌株JY02对小鼠的致病力明显高于100%多重耐药菌株KF-QX-1。
生物被膜的形成被认为是一种导致抗生素治疗失败的重要机制。与浮游细菌相比，这种生物膜特有表型能够激活其耐药机制，使生物膜细菌耐药能力提高10倍～1 000倍[13-14]。本研究结果显示有多株猪源屎肠球菌能形成生物被膜，但生物被膜形成能力与细菌耐药性无明显的相关性，究其原因可能是本研究的耐药性检测是在猪源屎肠球菌浮游状态下进行的，也从而推断细菌生物被膜耐药与耐药基因耐药是相对独立的作用机制。
另外，文献报道细菌生物被膜不仅对抗菌药物耐药，而且还可逃避宿主免疫系统的清除作用，是造成其在自然界持续感染的重要原因之一[14-15]。但是目前对生物被膜的研究大多局限于其耐药性、对环境抵抗力及造成持续感染方面，未见细菌的生物被膜形成能力与致病力呈正相关的报道。本研究通过对细菌致病性及生物被膜形成能力测定表明，细菌的生物被膜形成能力的强弱与其致病力无明显的正相关性。
本研究中9株猪源屎肠球菌的致病力与耐药性、生物被膜形成无明显的相关性，提示细菌的致病力是由多因素协同作用的结果。但具有生物被膜形成及多重耐药两种特性会增强猪源屎肠球菌的耐药性和传播性，给人类和动物的疾病控制造成更大的威胁。
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Correlation analysis among pathogenicity and antibiotic resistance and capability of biofilm formation of
Enterococcus faeciumisolated from swine
LU Cai-jing,ZHANG Xiu-ping,CHEN Lu,ZHAO Jun,WANG Xin-wei,JING Wen-xian,CHANG Hong-tao,LIU Hong-ying,YAO Hui-xia,WANG Chuan-qing,YANG Xia*
(Institute of Poultry Diseases,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China）
This study was conducted to determine the correlation between the biofilm formation and antibiotic resistance and pathogenicity inEnterococci faeciumisolated from swine.The 9 isolates were tested for pathogenicity through animal experiments and identified for the biofilm formation using microtiter plate method and antibiotic resistance by antimicrobial susceptibility test.The results showed that 66.67%of theEnterococciwere manifested comparatively strong virulence,showing the high short-term mortality and mainly with serious hemorrhagic lesions in liver and spleen.Multidrug resistance(≥3 antibiotics）was found in all ofE.faecium,which were KF-QX-1(100%）,ZKXH01(95.24%）,NY01(90.48%）,NY-XY-4(80.95%）,SBLH(76.19%）,HUAX(71.43%）,NY-XY-1(71.43%）,ZHENGY(66.67%）and JY02(14.29%）.Biofilm assay indicated that 8 of 9E.faeciumwere able to form biofilm in different degrees,of which JY02 and NY-XY-1 developed relatively strong biofilm.In conclusion,these results revealed that no significant correlation was found among antibiotic resistance,biofilm formation and pathogenicity to animal for theE.faeciumisolates.
Enterococci;pathogenicity;antibiotic resistance;biofilm formation;correlation
S852.61
A
1008-0589(2014）05-0350-04
10.3969/j.issn.1008-0589.2014.05.04
*Correspondingauthor
2013-07-24
国家农业科技成果转化项目(30500254）
卢彩景(1990-），女，河南登封人，硕士研究生，主要研究方向为分子病原学研究.
*通信作者：E-mail：yangxia66@163.com.
(本文编辑：彭永刚）
