中国部分重点地区牛结核病的γ-干扰素试验流行病学调查

张喜悦，曹 瑞，杜鹏飞，许 芳，束鸿鹏，呼西旦，范伟兴*

(1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000）

中国部分重点地区牛结核病的γ-干扰素试验流行病学调查

张喜悦1，曹 瑞1，杜鹏飞1，许 芳1，束鸿鹏1，呼西旦2，范伟兴1*

(1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000）

为调查部分省份牛结核病(bTB）的流行情况，我们在山东等14个省份34个历史上疫情较重的县共129个场户采集牛全血2 201份，采用CO2培养箱或蜡罐方法进行bTB γ-干扰素检测，结果显示样品的个体阳性率为6.4%，群阳性率为42.6%。饲养模式对bTB感染影响的统计显示较大规模场的个体阳性率(6.9%）和群阳性率(60%）均高于散养户(分别为5.7%和35.6%）。而牦牛样品的检测结果均为阴性。5个牛群的禽型PPD阳性统计结果显示牛型PPD阳性率越高，则禽型PPD阳性牛在牛型PPD阳性牛中的所占比率越低。在所有阳性牛群中，阳性率≥10%的牛群所占比例高达81.8%(45/55），bTB感染呈现出一个“群发性”的特征。

牛结核病；γ-干扰素试验；流行病学调查

牛结核病(Bovine tuberculosis，bTB）主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis）引起的一种牛的慢性消耗性传染病，该病可以感染人[1]。目前bTB的检疫主要是由县级动物疫病控制机构进行，缺乏国家层面上流行病学调查的直接数据。我国bTB的法定检疫方法是颈部牛型结核菌素试验(PPD）皮内变态反应，该方法需要在牛场进行临床检测，而且72 h后必须再次返回牛场测定皮厚，耗时耗力。牛全血γ-干扰素(INF-γ）试验是bTB诊断的一种新方法，该方法在欧盟和美国等发达国家已经得到了承认[2-3]，成为继变态反应之外的唯一的法定活畜诊断试验。为了解国内部分地区bTB的感染状况，我们尝试在部分历史上bTB感染严重的地区，利用INF-γ试验进行了bTB流行病学调查，为该病的防制提供了实验依据。

1 材料和方法

1.1 样品来源及检测试剂盒 在国内的14个省份，历史上牛结核菌感染严重的34个县129个场(户）采集全血样品共计 2 201份(含牦牛血样 179份）。BOVIGAMTM牛结核分枝杆菌INF-γ检测试剂盒购自Prionics公司。

1.2 抗原刺激 每头牛采集5 mL血液肝素抗凝血液，室温下于24 h内运送到实验室。将采集的每份抗凝全血各取1.5 mL加入细胞培养板的3个不同孔中，取100 μL INF-γ检测试剂盒中的牛型PPD、禽型PPD和阴性对照PBS，分别加入至抗凝全血中，混匀后于5%CO237℃培养16 h。收集上清液(即为刺激产生的INF-γ上清液）。将其进行ELISA试验。

1.3 单纯牛型P P D刺激上清I N F-γ方法与国标方法的比对试验 对106头牛血液样品的刺激上清利用牛INF-γ ELISA按照试剂盒说明书方法进行检测。在单克隆抗体包被板中加入样品，作用后加入酶标检测抗体，再次作用后加入底物显色、终止并判定结果。当牛型PPD刺激上清的OD450nm值-PBS刺激上清的OD450nm值≥0.1为阳性，反之为阴性。同时应用现行的国标方法即牛型PPD颈部皮内变态反应试验对106头牛进行检测，比较2种方法的符合率。

1.4 C O2培养箱方法与蜡罐方法进行I N F-γ E L I S A的比对试验 采集已知的21头INF-γ阳性反应牛和30头INF-γ阴性反应牛的全血，加入牛型PPD等试剂进行刺激，将细胞培养板置于CO2培养，即为CO2培养箱方法；将细胞培养板置于密封培养罐，罐内点燃蜡烛产生CO2后于37℃培养，然后获取INF-γ刺激上清，即为蜡罐方法，比较2种方法的符合性。

1.5 部分重点地区b T BP P D刺激上清的检测 对采集的2 201份全血分别应用牛型PPD、禽型PPD和PBS进行刺激，16 h后收获刺激上清。收获的刺激上清保存于-20℃，采用BOVIGAMTMELISA试剂盒进行INF-γ检测。

1.6 部分牛群禽型P P D阳性样品与牛型P P D阳性样品的比对试验 选取牛型PPD阳性率不同的5个牛群的阳性样品，应用BOVIGAMTM试剂盒同时检测牛型PPD、禽型PPD和PBS刺激上清。当禽型PPD刺激上清OD450nm值-PBS刺激上清OD450nm值>0.1，并且牛型PPD刺激上清OD450nm值-禽型PPD刺激上清OD450nm值<0.1时，判定为禽型PPD阳性。计算其禽型PPD阳性牛在牛型PPD阳性牛中所占的比例，统计不同牛群禽分枝杆菌等引发的非特异性反应比例。

1.7 结核阳性牛群群内阳性情况的统计 在监测的所有牛群中，分别计算结核阳性牛群中牛型PPD阳性率<10%的牛群和≥10%的牛群数量，统计牛型PPD阳性率≥10%的牛群在所有结核阳性牛群中所占的比例，调查结核阳性牛群的群内阳性情况。

2 结 果

2.1 单纯牛型P P D刺激上清I N F-γ检测方法与国标方法的比对试验 106头牛的INF-γ试验仅统计其牛型PPD刺激上清减去PBS刺激上清的结果，与国标方法牛型PPD皮内变态反应试验进行比对。结果单纯牛型PPD刺激上清INF-γ检测方法与国标方法检出的双阳性牛为78头，双阴性牛为21头，两者之间的符合率为93.4%(99/106）(表1）。2.2 C O2培养箱方法与蜡罐方法进行I N F-γ检测的比对试验 采集已知的21头INF-γ阳性反应牛和30头INF-γ阴性反应牛的全血，分别应用CO2培养箱和蜡罐方法进行试验，结果21头阳性牛在CO2培养箱和蜡罐方法的检测中均为阳性，30头阴性牛在CO2培养箱和蜡罐方法的检测中均为阴性。两组数据无明显差异(p>0.05）(表2）。

表1 INF-γ检测方法与国标方法的比对试验结果Table1 Comparison of IFN-γ test and single cervical test(SCT）

表2 CO2培养箱方法和蜡罐方法进行INF-γ检测的比对试验Table 2 Comparison fermenter and CO2incubator for IFN-γ test

2.3 部分地区b T BP P D刺激上清的流行病学监测结果

2.3.1 样品的总阳性率检测结果在山东等14个省份的34个历史上疫情较重的县共129个场户采集牛全血2 201份，分别采用牛型PPD、禽型PPD和PBS刺激后收获上清，使用BOVIGAMTMELISA试剂盒进行检测。根据结果2.1的结论，仅检测牛型PPD与PBS刺激上清。阳性样品为194份，样品的表面阳性率为8.81%。参考BOVIGAM试剂盒在美国、澳大利亚等11个国家的应用数据，其平均敏感性和特异性分别为88.3%和96.6%[4]。应用Win Episcope2.0软件分析，将阳性率、试剂盒的敏感性和特异性数据代入，经计算这些地区的真实阳性率为6.37%。同样应用软件对每个群进行分析，结果共检测129个群，其中55个为真实阳性群，群阳性率为42.6%。

2.3.2 阳性样品的地域分布除本次流行病学调查并未涉及的东南地区外，东北、西北、西南和华中地区均有阳性样品，应用Win Episcope2.0软件分析，样品的真实阳性率从0.8%～10.4%不等，群阳性率从9.1%～52.6%不等(表3）。地域分布显示，东北、华北、西北及华中均有bTB的感染。

2.3.3 不同饲养模式之间的阳性率对比将牛场和采集样品30头及以上的养殖户作为较大规模场，其他的个体养殖户作为散养户，对比较大规模场和散养户的群间差异。经软件分析后的结果表明，较大规模场的个体阳性率(6.9%）和群感染率(60%）均高于散养户(分别为5.7%和35.6%）(表4）。

表3 不同地区检测bTB阳性率Table 3 Positive rates of bovine TB in difference regions

表4 不同调查饲养模式之间的阳性率对比Table 4 Comparison of prevalence in differente feeding scale

2.4 局部地区牦牛样品的流行病学调查 在西藏、甘肃的4个县，采集牦牛全血样品179份，利用蜡罐方法在当地进行牛型PPD、PBS刺激后，收获全血刺激上清带回青岛进行检测。经软件分析，结果样品的真实阳性率和群阳性率均为0%(表5）。

表5 我国局部地区牦牛的bTB感染状况Table 5 IFN-γ test for yak in 5 herds of Southwest China

2.5 部分牛群禽型P P D阳性样品与牛型P P D阳性样品的比对试验 选取牛型PPD阳性率分别为3.30%(1/30）、6.70%(2/30）、17.90%(5/28）、26.10%(6/23）和40%(10/25）的5个牛群的阳性样品，应用BOVIGAMTM试剂盒同时检测牛型PPD、禽型PPD和PBS刺激上清。结果禽型PPD阳性牛在牛型PPD阳性牛中所占的百分比分别为100%(1/1）、50%(1/2）、20%(1/5）、16%(1/6）和 0。这5个牛群的牛型PPD感染率越高，禽型PPD阳性牛在牛型PPD阳性牛中的比率越低。

2.6 结核阳性牛群内个体阳性率的统计 监测的所有149个牛群中，有55个牛群为结核阳性牛群。在这55个牛群当中，阳性率<10%的有10个牛群，阳性率≥10%的有45个牛群。阳性率≥10%的牛群占所有阳性牛群的比率为81.8%(45/55）。表明，在所有阳性牛群中，感染严重牛群所占的比例很高，即每当发现一个bTB阳性牛群，其阳性率往往比较高，bTB感染呈现一个“群发性”的特征。

3 讨 论

目前国际上认可的活体检测方法主要有变态反应试验(SCT的敏感性为80%～91%、特异性为75.5%～96.8%，比较变态反应的敏感性为55.1%～93.5%、特异性为88.8%～100%）和bTB INF-γ试验(敏感性和特异性分别为80.9%～100%、87.7%～99.2%）等方法[5-10]。虽然我国中西部地区的部分县级动物疫病控制机构没有配备CO2培养箱，不能进行INF-γ检测，但试验表明蜡罐方法可以替代CO2培养箱方法，最终我们选择bTB INF-γ试验进行该病的流行病学调查。实验过程中的部分阳性样品，牛型PPD刺激上清OD值减去禽型PPD刺激上清OD值之后小于0.1，应判为阴性结果，但牛型PPD刺激上清的OD值为强阳性。这种情况下应参考群的感染状况判定结果，如果有证据认为该群为感染牛群，仍将该样本判为阳性牛。

实验表明较大规模场的个体阳性率和群阳性率均略高于散养户，该结果出乎我们的意料，但与Tschopp等的结果相符，他们也发现城市和城市周边大型奶牛场的阳性率要高于农户的阳性率[11]。分析本次调查所涉及的规模场，多是一些小型规模场或较大规模的养殖户，如果不能持续检疫，群内传播将会非常快，导致bTB的感染呈现出“群发性”的特征。bTB INF-γ试验检测牦牛的结果均为阴性，这可能是由于在高原地区缺氧，应用蜡罐方法导致CO2的产生不足引起的，但该推断需要进一步的试验验证。

[1]World Organisation for Animal Health(OIE）.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[EB/OL].http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.04.07_BOVINE_TB.pdf,2013-03-01.

[2]United States Department of Agriculture.Bovine tuberculosis eradication uniform methods and rules[M].New York:Law Press,2005,14-19.

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[4]Veterinary Laboratory Agency.Specificity Trial of the BOVIGAMIFN-Gamma Test in GB Cattle[EB/OL].http://archive.defra.gov.uk/foodfarm/farmanimal/diseases/atoz/tb/documents/gifn_specificityreport.pdf,2013-03-01.

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[10]Ryan T J,Buddle B M,De Lisle G W.An evaluation of the gamma interferon test for detecting bovine tuberculosis in cattle 8 to 28 days after tuberculin skin testing[J].Res Vet Sci,2000,69(1）:57-61.

[11]Tschopp R,Abera B,Sourou S Y,et al.Bovine tuberculosis and brucellosis prevalence in cattle from selected milk cooperatives in Arsizone,Oromia region,Ethiopia[J].BMC Vet Res,2013,9:163-169.

Survey of bovine tuberculosis in several area of China by gamma interferon assay

ZHANG Xi-yue1,CAO Rui1,DU Peng-fei1,XU Fang1,SHU Hong-peng1,HU Xi-dan2,FAN Wei-xing1*

(1.China Animal Health＆Epidemiology Center,Qingdao 266032,China;2.Veterinary Research Institute,Animal Science Academy of Xinjiang,Wulumuqi 830000,China）

To investigate the prevalence of bovine tuberculosis(bTB）in some provinces,a total of 2,201 samples of bovine blood were collected from 129 herds with bTB epidemic history in 34 counties of 14 provinces and the plasmas stimulated by bovine PPD,avian PPD and PBS for detection of bovine TB by interferon-γ (INF-γ）test.The results shown that the positives of bovine TB for individual cattle and herds were 6.4%and 42.6%,respectively,detecting the plasma stimulated by bovine PPD in fermenter or CO2incubator.In addition,the positives of bovine TB for individual cattle and herds were 6.9%and 60%in the larger scale farmers which were both higher than in the rural farmers(5.7%and 35.6%respectively）.However,no positive sample was detected in yak.While,by detecting the 5 herds,it was shown that the percentage of avian PPD positive to bovine PPD positive increased when bovine PPD positive rate decreased.The character of"group infection"was disclosed as the 81.8%of serious infected herds(≥10%）to all infected herds.

bovine tuberculosis;IFN-γ test;surveillance

S852.61

A

1008-0589(2014）05-0359-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.05.06

*Correspondingauthor

2013-11-28

科技基础性工作专项(2012FY111000）；现代农业(奶牛）产业技术体系建设项目(CARS37）

张喜悦(1974-），男，河南浚县人，博士研究生，副研究员，主要从事人畜共患病流行病学研究.

*通信作者：E-mail：fwxsjl@126.com

(本文编辑：赵晓岩）