MMP-9及K iss-1在乳腺癌组织中的表达及相关性分析

水一方，高艳丽，李孟圈

（1.郑州大学第一附属医院 乳腺外一科 河南 郑州 450000；2.郑州市卫生学校 药理学教研室 河南 郑州 450005）

MMP-9及K iss-1在乳腺癌组织中的表达及相关性分析

水一方1，高艳丽2，李孟圈1

（1.郑州大学第一附属医院 乳腺外一科 河南 郑州 450000；2.郑州市卫生学校 药理学教研室 河南 郑州 450005）

目的：探讨MMP-9和Kiss-1在乳腺癌组织中的表达情况及相关性。方法：选取乳腺浸润性导管癌和癌旁正常乳腺组织标本各60例，采用免疫组化S-P法检测MMP-9、Kiss-1的表达情况，并对其与临床病理因素的关系以及两基因间的相关性进行分析。结果：MMP-9在乳腺癌组织中的的阳性表达率为58.3％，明显高于正常乳腺组织中的阳性率28.3％，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Kiss-1在乳腺癌组织的阳性率为20.0％，低于癌旁组织的阳性表达率63.3％，差异具有统计学意义（P＜0.05）。MMP-9的表达与淋巴结转移、临床分期有关（P＜0.05），与年龄、肿块的大小和组织学分级等因素无关（P＞0.05）。Kiss-1的表达与淋巴结转移有关（P＜0.05），与年龄、临床分期、组织学分级及肿瘤大小无关（P＞0.05）。乳腺癌组织中Kiss-1表达与MMP-9表达呈负相关（r=-0.690，P＜0.05）。结论：MMP-9高表达及Kiss-1低表达可能与乳腺癌的浸润、转移有关，Kiss-1可能对MMP-9的表达具有抑制作用。

乳腺癌；细胞外基质金属蛋白酶-9；Kiss-1基因；浸润；转移

乳腺癌现今已成为严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一，其发生发展是一个涉及多基因、多阶段的过程，侵袭和转移是其重要的生物学行为，与预后密切相关。研究认为，原发部位的肿瘤细胞可浸润并穿透组织基底膜，避开机体的免疫监视和反应，通过血管和淋巴管进入新的实质组织，促使新的肿瘤血管形成，导致原发病灶以外的转移灶的形成［1］。MMP-9是细胞外基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）家族中重要的成员之一，可以通过降解细胞外基质蛋白中的胶原和非胶原成分而导致广泛的组织损伤，从而导致肿瘤的侵袭和转移。Kiss-1基因是Lee等［2］通过对黑色素瘤细胞株的研究发现和证实的一个新的抑癌基因。研究表明，其表达的降低或缺失与人类多种恶性肿瘤的转移存在相关性。本研究通过检测 Kiss-1、MMP-9在乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织中的表达情况，探讨它们与肿瘤细胞侵袭、浸润生长及通过淋巴和血行发生转移的生物学行为是否存在一定关联，以期为乳腺癌患者的病情判断和治疗提供有价值的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取郑州大学第一附属医院2009年9月至2013年3月经病理检查确诊为乳腺浸润性导管癌和癌旁4 cm以外正常乳腺组织的石蜡包埋标本各60例，术前均未经抗肿瘤治疗（化疗、放疗、生物靶向治疗）。患者年龄为18～81岁；绝经前32例；绝经后28例；肿瘤直径为1.5～12.0 cm；腋窝淋巴结转移阳性者33例，阴性者27例。乳腺癌TNM（tumor node metastasis）分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期29例，Ⅲ期19例，Ⅳ期3例。组织学分级：Ⅰ期8例，Ⅱ期43例，Ⅲ期9例。

1.2 试剂与方法 采用免疫组化S-P法检测Kiss-1、MMP-9在乳腺癌组织中的表达情况。兔抗人Kiss-1 metastin（45-54）-NH2单克隆抗体购自康肽生物科技（北京）有限公司；鼠抗人MMP-9单克隆抗体及相应的二抗试剂盒，以及SP试剂均购自北京中杉生物技术有限公司。用S-P法对全部乳腺癌及正常乳腺组织进行免疫组化染色，实验严格按照试剂说明书操作进行：将乳腺癌标本和癌旁正常乳腺组织经10％福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，采用免疫组化S-P法，PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色。

1.3 结果的判断 染色后，在高倍视野下每张切片随机选择10个视野，每个视野计数100个细胞，共计数1 000个细胞，观察其染色情况及阳性细胞百分比。MMP-9定位于细胞质，以癌细胞浆内出现棕黄色颗粒判为阳性细胞，阳性细胞数＞15％为阳性，阳性细胞数≤15％为阴性。Kiss-1蛋白主要定位于胞质中，阳性染色为淡黄色、黄色以及棕褐色。根据染色强度和阳性细胞百分比进行分级，评分采用二级计分与阳性细胞计数法相结合的方法。根据阳性细胞所占百分比分为4类：5％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分；按染色强度分类：棕褐色为3分，黄色为2分，淡黄色为1分，以两者得分数乘积为总分，＞1判为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，定性资料组间比较采用 χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MM P-9及K iss-1在不同乳腺组织中的表达情况 MMP-9在乳腺癌组织中的的阳性表达率为58.3％（35/60），明显高于正常乳腺组织中的阳性率28.3％（17/60），差异具有统计学意义（P＜0.05）。Kiss-1在乳腺癌组织的阳性率为20.0％（12/60），低于癌旁组织的阳性表达率63.3％（38/60），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 MM P-9及K iss-1表达与乳腺癌临床及病理因素的关系 MMP-9的表达与淋巴结转移、临床分期有关（P＜0.05），与年龄、肿块的大小和组织学分级等因素无关（P＞0.05）。Kiss-1的表达与淋巴结转移有关（P＜0.05），与年龄、临床分期、组织学分级及肿瘤大小无关（P＞0.05）。见表1。

2.3 K iss-1与MM P-9表达的相关性 相关性分析结果显示，乳腺癌组织中Kiss-1表达与MMP-9表达呈负相关（r=-0.690，P＜0.05）。见表2。

3 讨论

乳腺癌的转移和复发是影响患者预后的重要因素，癌细胞对基底膜的破坏是其向邻近纤维结缔组织浸润和向远处器官转移过程的最基本步骤。正常组织基底膜对一般上皮细胞具有一定的阻挡作用，即便在炎症、组织愈合、重建等特殊的病理生理变化时，细胞可以暂时穿透基膜，但组织可通过自我修复而恢复其完整性。

表1 MMP-9及Kiss-1的表达与乳腺癌临床及病理因素的关系

表2 乳腺癌组织中Kiss-1与MMP-9表达的相关性

MMP-9也称明胶酶B，是一种蛋白水解酶，其特有的功能域能高效降解Ⅳ型胶原。正常的基膜是细胞外结构，是由Ⅳ型胶原参与组成的一层严密、均一的稳固而密实的防护层。Ⅳ型胶原对维持基膜的完整性起着十分重要的作用。在恶性肿瘤的发生发展过程中有不同程度的基膜缺损，为肿瘤局部生长、侵袭以及远处转移创造了一定的条件［3］。本研究显示，MMP-9在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义；随临床分期的提高，MMP-9的阳性率也越来越高。越高的临床分期往往提示肿瘤细胞具有更高的侵袭力，甚至在发病时已伴有远处转移灶，复发的风险也往往随着临床分期的提高而增大。此外，淋巴结转移组的阳性率也明显高于无转移组，表明MMP-9可能在乳腺癌的淋巴结转移过程中起到重要作用，而淋巴结转移情况现今已成为指导临床治疗的重要指标。这些都提示检测MMP-9的表达或许有助于对乳腺良恶性疾病的鉴别，同时也有望成为预判乳腺癌的恶性程度与淋巴结转移潜能的可靠指标，从而为临床诊疗工作提供更多的实验理论依据。

Kiss-1基因已被证实为一种抑癌基因，Kiss-1表达的缺失与黑色素瘤、膀胱癌以及子宫内膜癌等肿瘤的侵袭和转移的关系已得到证实［4-5］。Lee等［2］发现，通过对实验组裸鼠接种Kiss-1过表达的人乳腺癌细胞株，发现肿瘤转移降低了95％，这是首例经实验证实的Kiss-1能够抑制乳腺癌的转移。后续的研究则发现，Kiss-1在高侵袭性的乳腺癌细胞中表达存在缺失情况［6］；且乳腺癌细胞经Kisspepetin处理后，细胞侵袭力明显减弱，骨转移可被抑制［7］。本研究结果显示，癌旁正常乳腺组织Kiss-1的阳性率明显高于乳腺癌组织中的阳性率，说明乳腺癌的发生与Kiss-1的表达缺失或失活存在相关性。淋巴转移组Kiss-1的阳性表达明显低于无转移组，随着临床分期的进展，阳性表达下降，这些提示该基因可能参与了乳腺癌转移的调控，并且具有抑制乳腺癌转移的潜能。Kostadima等［8］在272例伴淋巴结转移的乳腺癌原发灶组织中仅检测到8例有Kiss-1的表达，提示在发生淋巴结转移的乳腺癌病例中确实存在Kiss-1表达缺失的情况；此外，Kiss-1基因在乳腺癌伴有脑转移灶的病例中表达较原发病灶明显降低，而Kiss-1高表达的病例无转移生存期更长［9］。

Kiss-1可通过抑制基质金属蛋白酶（MMPs）相关通路阻止细胞外基质和基底膜被降解，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。现研究表明，在乳腺癌组织中Kiss-1与MMP-9的表达呈明显负相关。其机制可能为：Kiss-1抑制了nf-κb途径，上调nf-κb抑制物，使胞浆中nf-κb的核内转移受到抑制，导致与MMP-9启动子结合的nf-κb减少，从而使MMP-9表达下调，从而抑制乳腺癌或其他肿瘤细胞的转移［10］。本研究结果显示，Kiss-1的表达与MMP-9的表达存在负相关，这或许可以说明Kiss-1作为一类基因可以通过对MMP-9的表达调控而参与乳腺癌的侵袭和转移，但限于本实验病例数的限制，更为严谨的结论应该通过大量、长期的研究而得出。

通过该研究表明，MMP-9及Kiss-1表达的上调和下调均与乳腺癌的发生、转移有关。在未来的临床实践中，如能同时兼顾二者的检测，或许有助于筛选高危患者，制定更为合理有效的治疗方案，甚至可辅助鉴别乳腺癌及良性乳腺疾病。

［1］王祥军，吴新勇，何长青，等.CD147和MMP-9在乳腺癌中的表达及其与微血管生成的相关性研究［J］.现代肿瘤医学，2010，18（7）：1318-1321.

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［3］李欣，张志刚，孙金豹.Kiss-1、NF-kB及MMP-9在子宫内膜病变中的作用及关系的研究进展［J］.中国社区医师：医学专业，2011，13（36）：236-237.

［4］张文娟，朱志杰，蔡旺.子宫内膜样癌中RhoGDI2和Kiss-1表达的关系［J］.中国老年学杂志，2013，33（15）：3608-3610.

［5］宋永胜，张辉，尚超.KISS-1基因与膀胱癌转移的相关性及其稳定表达对细胞侵袭能力影响［J］.中国医科大学学报，2010，（3）：168-170.

［6］朱荣，曹方，王阔，等.Kiss-1基因在人乳腺癌组织中的表达及意义［J］.江苏大学学报：医学版，2013，23（5）：450-451.

［7］Olbrich T，Ziegler E，Türk G，et al.Kisspeptin-10 inhibits bone-directed migration of GPR54-positive breast cancer cells：Evidence for a dose-window effect［J］.Gynecol oncol，2010，119（3）：571-578.

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［10］白云.KiSS-1、NF-κBp65和MMP-9在非小细胞肺癌中的表达及意义［D］.天津：天津医科大学，2010.

Expression and correlation of matrix metalloproteinase-9 and K iss-1 in breast cancers

SHUIYifang1，GAO Yanli2，LIMengquan1

（1.The First Department of Breast Surgery，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China；2.Department of Pharmacology，Zhengzhou Health School，Zhengzhou 450000，China）

Objective：To study the expression ofmatrix metalloproteinase-9（MMP-9）and Kiss-1 and the correlation in breast cancer.Methods：The expression of MMP-9 and Kiss-1 was detected by immunohistochemistry streptavidin-peroxidase method in 60 cases of breast cancer and 60 cases of normal tissue adjacent to tumor.The relationship between MMP-9，Kiss-1 and clinicopathologic features of breast cancer was analyzed.The correlation of MMP-9 and Kiss-1 was analyzed.Results：The positive expression rate of MMP-9 in breast cancer was 58.3％，much higher than normal breast tissues with 28.3％（P＜0.05）.The positive expression rate of Kiss-1 in breast cancer was 20.0％，lower than normal breast tissues with 63.3％（P＜0.05）.The expression of MMP-9 was related to lymph node metastasis and clinical stage but unrelated with age，histological stage and the size of tumor.The expression of Kiss-1 was related to lymph nodemetastasis but unrelated with with age，clinical stage，histological stage and the size of tumor.The expression of MMP-9 was negatively correlated with the expression of Kiss-1 in tissues of breast cancer.Conclusion：The high expression of MMP-9 and low expression of Kiss-1 may be related to the metastasis and invasion of breast carcinoma，and Kiss-1 may inhibit the expression of MMP-9.

breast cancer；matrix metalloproteinase-9；Kiss-1 gene；invasion；metastasis

R 737.9

10.3969/j.issn.1004-437X2014.11.003

李孟圈，E-mail：lmql0332@126.com。

2014-08-23）