乳腺癌T细胞受体α链全长编码序列多重PCR扩增方法的建立

张建波，吕晓东，楚广民，宋 魏，冯 稳，刘明阁，于庆凯

（郑州大学附属肿瘤医院 病理科 河南 郑州 450003）

乳腺癌T细胞受体α链全长编码序列多重PCR扩增方法的建立

张建波，吕晓东，楚广民，宋 魏，冯 稳，刘明阁，于庆凯

（郑州大学附属肿瘤医院 病理科 河南 郑州 450003）

目的：建立乳腺癌克隆性T细胞TCRα链全长编码序列（CDS）的多重PCR扩增方法。方法：根据GenBank现有TCR序列设计扩增TCRα链32个亚家族上游引物35条，下游引物2条。对Mg2+、dNTPs和引物浓度比例以及退火温度进行优化，确定最佳反应体系进行TCRα链多重PCR扩增，构建重组质粒并酶切鉴定。结果：扩增出乳腺癌转移淋巴结中的TCRα链全长编码序列并构建重组质粒，5例患者共获得23个阳性克隆。结论：建立的TCRα链多重PCR扩增方法具有特异、快速、简便的特点，可为研究乳腺癌克隆性T细胞提供帮助。

T细胞受体；多重PCR；质粒

近年来，乳腺癌发病率呈上升趋势，约占女性恶性肿瘤的30％，占女性恶性肿瘤致死率的15％左右［1］。乳腺癌患者转移淋巴结中存在针对肿瘤抗原特异反应的T细胞克隆，分析这些克隆性增生的 T细胞，可以了解机体TCR亚家族限制性取用及CDR3谱型等机体抗肿瘤免疫应答情况［2］。由于TCRα链由Vα-Jα-Cα基因片断重排后编码，构成具有不同特异性的TCR分子，由此决定 T细胞识别抗原的多样性和特异性，从而可对环境中千变万化的抗原产生特异性应答［3］。本研究的目的是建立特异、快速、简便的多重PCR扩增方法扩增TCRα链全长编码序列，为分析乳腺癌患者转移淋巴结中克隆性增生 T细胞的特点等进一步研究提供帮助。

1 材料和方法

1.1 标本 选取河南省肿瘤医院确诊为乳腺浸润性导管癌（组织学II级）住院患者5例，均为女性，年龄28～73岁，经术中快速冰冻检查明确腋窝前哨淋巴结有癌微转移标本。同时取2例反应性增生淋巴结标本作为对照。

1.2 材料 TRIzol、SuperScript III Reverse Transcriptase（美国Invitrogen公司），Advantage 2 Polymerase M ix（美国BD公司），Taq DNA Polymerase、Restriction Endonucleases（Xbal、EcoRⅠ、KpnⅠ）、T4 DNA Ligase、pGEM-7Zf（+）Vector（美国Promega公司），E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit（美国Omega公司），QIAEX II Gel Extraction Kit（德国QIAGEN公司），PCR仪（美国MJ research公司）。

1.3 RNA提取及cDNA合成 将癌转移淋巴结周围的淋巴组织及对照组淋巴结标本在200目筛网上进行研磨后用PBS进行冲洗，收集细胞悬液并计数，提取总RNA合成20μl cDNA。

1.4 引物的设计 根据GenBank现有TCR序列设计TCRα链的上游引物35条，下游引物2条［4］。上游引物分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶识别序列，下游引物引入 Xbal限制性内切酶识别序列。并将TCRα链终止密码TGA改为TAA以避免甲基化（引物由上海英俊生物技术公司合成）。

1.5 多引物PCR分别扩增TCRα链全长序列 根据退火温度不同分为 7组，每组引物 4～12对。各PCR反应体系中引物浓度、退火温度及Mg2+浓度分别经梯度PCR进行优化，引物终浓度是10μmol/L，Mg2+终浓度1.5 mmol/L，退火温度在50～65℃。总反应体系50μl，其中10×Buffer 5μl，MgCL23μl，dNTP 1μl，上、下游混合引物各0.5μl，cDNA 1μl，Taq酶（5u/μl）0.5μl，各反应体系引物终浓度是10μmol/L，Mg2+终浓度1.5 mmol/L。反应条件为：预变性95℃5 min；95℃40 s，50～65℃1 min，72℃1 m in 50 s，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物上1％琼脂糖凝胶电泳。

1.6 构建重组质粒及酶切鉴定 PCR阳性产物纯化回收后经Kpn I和Xbal、EcoRI和Xbal酶切，与相应酶切质粒pGEM-7Zf（+）进行连接反应并转化感受态细胞E.coli JM109，挑取氨苄青霉素抗性菌落，增菌培养后提取质粒，酶切并上1％琼脂糖凝胶电泳。

2 结果

2.1 TCRα链全长序列的多重PCR扩增 将多重PCR扩增产物上1％琼脂糖凝胶电泳，部分扩增体系在800 bp左右有目的条带，对照组反应性增生淋巴结标本各反应体系均有扩增，见图1。

1～5：TCRα链多重PCR扩增产物；6：阴性质控；M：DNA分子量标准。

2.2 重组质粒的PCR、酶切鉴定 阳性克隆酶切电泳可见两条泳动速度不同的条带，分别与PCR扩增产物和空质粒双酶切后的大小一致，见图2。经鉴定5例患者分别获得阳性克隆数为5个、4个、4个、5个、5个，共23个阳性克隆。

图2 TCRα链PCR产物及重组质粒酶切鉴定

3 讨论

TCR是T细胞表面的抗原受体，参与抗原的特异性识别。编码TCRα链的基因由许多不连续的可变区基因（AV），连接基因（AJ）和恒定区基因（AC）组成。根据TCR AV核苷酸同源性是否大于75％，可以把TCR AV分为32个功能性基因家族。AV基因片段的下游有50～70个AJ基因片段和1个AC基因片段［3］。分析乳腺癌患者体内 T细胞的克隆性增生情况及其CDR3谱型，可反映特定T细胞克隆扩增的程度及T细胞抗肿瘤免疫功能状态［5］。

本研究建立克隆性T细胞的多重PCR方法，扩增TCRα链全长序列，具有快速、特异、简便的优点。但是多重PCR并非单一引物对PCR的简单组合，其中Mg2+、dNTPs、引物浓度、退火温度、酶的用量以及循环条件等均需进行优化。经梯度PCR摸索反应条件，显示较低引物浓度可减少非特异条带的扩增。适当降低退火温度，延长变性、退火、延伸时间，增加变性温度、循环时间和循环次数可以有效地增加PCR产物的产量，而Mg2+、dNTPs的浓度、酶的用量则与单独扩增时相似。

利用该方法对5例乳腺癌转移淋巴结TCRα链进行扩增，构建重组质粒经酶切鉴定共获得23个阳性T细胞克隆，与PCR-序列分析方法相比一定程度上减少了工作量，由于扩增的是TCRα链全长编码序列，可进一步完整地分析所有核苷酸和氨基酸序列，扩增的序列还可用于体外表达，避免了PCR-GeneScan（基因扫描）-序列分析［6］只扩增 TCR部分序列的不足，而且不受CDR3长度的影响，为研究肿瘤相关T细胞克隆，以及分析其TCR基因重排和CDR3谱型等打下了基础。

［1］Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer Statistics［J］.CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.

［2］张建波，宋永平，于庆凯，等.乳腺癌患者T细胞受体基因重排及CDR3区序列分析［J］.肿瘤研究与临床，2010，22（3）：179-181.

［3］Srivastava S K，Robins H S.Palindromic nucleotide analysis in human T cell receptor rearrangements［J］.PLoS One，2012，7（12）：e52250.

［4］张建波，方毅敏，黄艳，等.活动性肺结核患者α/βTCR基因重排及CDR3谱型分析［J］.中国免疫学杂志，2007，23（12）：1136-1139.

［5］Zhang M，Maiti S，Bernatchez C，et al.A new approach to simultaneously quantify both TCRα-andβ-chain diversity after adoptive im-munotherapy［J］.Clin Cancer Res，2012，18（17）：4733-4742.

［6］Blohm JH，Blohm N，Hummel M，et al.Detection of clonal T-cellreceptor（TCR）Vbeta rearrangements in exp lanted dilated cardiomyopathy hearts by semi-nested PCR，GeneScan，and direct sequencing［J］.Med Sci Monit Basic Res，2013，（19）：111-117.

Establishment of M ulti-PCR to am p lify the com plete DNA sequence of TCRαchains in patients w ith breast cancer

ZHANG Jianbo，LV Xiaodong，CHU Guangm in，SONG Wei，FENG Wen，LIU Mingge，YU Qingkai
（Department of Pathology，the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450003，China）

Objective：To establish a method of Multi-PCR to amplify the complete DNA sequence（CDS）of TCRαchains of clonal T cells in patientswith breast cancer.M ethods：The specific 35 upstream primers and 2 downstream primers for 32 subfam ilies were designed according to the sequences of TCRαchains provided by GeneBank.The multiplex PCR reaction system and condition was optimized to find out the best concentration of Mg2+，dNTPs and primers，and the best annealing temperature.The CDS of TCRαchains were amplified and then inserted into cloning vector.The recombinant constructs were identified by the endonucleases.Resu lts：The CDS of TCRαchains were amplified，and constructed the recombinant plasmid.There were 23 positive clones were received in 5 patients with breast cancer.Conclusion：Multi-PCR established in the study is specific，rapid，simple and convenient.It provides the technical support to analyse the Feature of clonal T cell in patients with breast cancer.

T-cell antigen receptor（TCR）；Multi-PCR；plasmid

河南省基础与前沿技术研究计划项目（102300410038）。

于庆凯，E-mail：yuqingkai@hot.mail。

R 737.9

10.3969/j.issn.1004-437X2014.11.002

2014-06-15）