聚乳酸手术保护膜在门脉高压大鼠贲门周围血管离断术中的应用

陈保星，许 冰，朱丙帅

（郑州大学第一附属医院 肝胆胰外科 河南 郑州 450052）

聚乳酸手术保护膜在门脉高压大鼠贲门周围血管离断术中的应用

陈保星，许 冰，朱丙帅

（郑州大学第一附属医院 肝胆胰外科 河南 郑州 450052）

目的：评价聚乳酸手术保护膜在门脉高压大鼠贲门周围血管离断术中防止粘连再生及减少新生血管的效果。方法：将40只SD大鼠随机分为实验组和对照组。两组均以部分门静脉结扎法建立肝前型门静脉高压症大鼠模型，对照组仅行贲门周围血管离断术，实验组行贲门周围血管离断术并用聚乳酸手术保护膜包绕贲门周围创面。术后第4周处死大鼠，观察贲门周围组织粘连情况，进行宏观分级，切取贲门及其周围粘连组织，将标本蜡块包埋后免疫组织化学染色观察白细胞分化抗原34（cluster of differentiation 34，CD34）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达情况，观察分析贲门周围组织粘连程度及新生血管生成情况。结果：腹腔脏器粘连宏观分级中，实验组较对照组粘连脏器相对较少，粘连分级明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。免疫组织化学显示，实验组在粘连程度及新生血管生成情况上均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：聚乳酸手术保护膜在一定程度上可以预防、减少门脉高压大鼠贲门周围血管离断术后粘连形成以及新生血管生成。

聚乳酸手术保护膜；贲门周围血管离断术；血管内皮生长因子；白细胞分化抗原34

贲门周围血管离断术可用于门静脉高压症的手术治疗［1］，它是通过阻断门静脉系统与奇静脉之间的侧支循环，以达到控制门静脉高压症引起的食管胃底静脉曲张破裂出血的目的，但术后仍有一定的再出血率，杨镇、陈立波等［2-3］报道单纯断流术组5年再出血率为3.3％～6.9％，10年再出血率为8.0％～13.3％。其中再出血原因可能包括：手术操作不规范、断流不彻底；术后门静脉高压引起贲门周围新生血管形成，致侧支循环再建复发出血等。聚乳酸手术保护膜是一种特殊的可吸收材料，能够有效的保护软组织，防止术后软组织粘连，减少术后创面粘连再生及新生血管形成。本实验拟通过门静脉主干部分结扎法复制大鼠肝前性门静脉高压症模型［4］，然后对该模型大鼠行贲门周围血管离断术，其中实验组行贲门周围血管离断术后应用聚乳酸手术保护膜包绕贲门创面，对照组单纯行贲门周围血管离断术，观察大鼠贲门周围组织的粘连情况，评估聚乳酸手术保护膜阻止贲门周围粘连形成及新生血管生成的效果，探讨其对治疗和再出血提供的线索。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雄性大白鼠由河南省实验动物中心提供；聚乳酸手术保护膜购自MAST Blosurgery Inc公司；VEGF（鼠抗人单克隆抗体）、CD34（鼠抗人单克隆抗体）购自Santa Cruz生物技术公司；SP试剂盒、DAB试剂盒购自北京中杉生物工程公司。

1.2 手术方法 将40只SD雄性大白鼠（180～200 g）随机分为两组，实验组和对照组各20只。饲养条件：于有通气装置的饲养箱中，温度20～25℃，湿度40％～60％，12 h光暗周期。手术前1周让大鼠对实验室环境进行适应。术前1 d晚上禁食12 h，手术当天禁食水。

以10％水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，无菌条件下作剑突下正中切口2.0～3.0 cm，进腹前生理盐水冲洗无菌橡胶手套。游离门静脉近肝端，在门静脉外缘平行放置1个外径为0.8 mm（21 G）的钝性针头，用3-0丝线结扎门静脉主干及与之靠近的钝性针头（结扎点尽量靠近门静脉左右分支处），拔出针头后即可形成门静脉部分结扎。实验组以无损伤钳彻底游离食管中下段及贲门后，剪取一1.5 cm×1.5 cm聚乳酸手术保护膜包绕贲门周围（见图1）。对照组仅游离食管中下段及贲门。术后4周处死大鼠，切取贲门及其周围粘连组织，生理盐水洗净后固定于4％甲醛液中，石蜡包埋、切片，进行VEGF、CD34免疫组织化学检验［5-6］。

图1 聚乳酸手术保护膜放置前后比较

1.3 评估标准

1.3.1 宏观分级：参考The Diamond Classification［7］，对贲门周围粘连范围、粘连组织韧性分级。粘连范围：0级贲门周围无粘连，1级贲门周围少许膜性粘连，2级肝左外叶、肝尾叶、贲门周围粘连，3级与膈肌间粘连条带形成，4级大网膜、小肠粘连。

1.3.2 免疫组化分析：①VEGF结果评定：VEGF蛋白阳性表达主要定位在胞浆或胞膜上，呈棕黄色或黄色的颗粒状物质。阳性标准：以细胞浆被染为棕黄（褐）色为阳性，反之则为阴性。采用形态学图像分析系统对各组免疫组化切片随机采集、放大，输入计算机，每张切片随机选取5个高倍视野（×400），测定平均积分光密度值显示相对含量。②微血管密度（MVD）的判定方法CD34阳性表达主要定位于血管内皮细胞的胞膜或胞浆中，呈现棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇团，其代表微血管密度（microvessel density，MVD）。按Weidner等［8］报道的计数方法，首先在低倍镜（×100）下扫视整个切片，以染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数，寻找3个血管密度最高的区域（即所谓“热点”），然后在200倍视野范围分别计数每个区域的微血管数，取其平均值。

1.4 统计学方法 使用SPSS 17.0统计软件，采用χ2检验、t检验、相关性分析，对实验数据进行统计学分析。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异统计学意义。

2 结果

2.1 腹腔脏器粘连宏观表现 对照组粘连范围所涉及脏器多为肝左外叶、肝尾叶、食管、胃底，少数存在大网膜、小肠粘连；实验组所涉及的粘连脏器多为肝左外叶、胃底，无大网膜及小肠粘连（见图2）。经统计学分析，两组在粘连分级中差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

图2 两组大鼠腹腔脏器粘连情况比较

表1 大鼠腹腔脏器粘连范围分级对比（n）

2.2 VEGF和CD34在各组标本中的表达 对照组大鼠贲门周围组织VEGF主要表达在粘连组织成纤维细胞或内皮细胞的胞浆或胞膜上，数量较多，呈强阳性表达；而实验组阳性细胞数较对照组明显减少（见图3），对照组大鼠贲门周围组织 VEGF值高于实验组，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

图3 VEGF在贲门周围粘连组织中的表达（×400）

同时通过CD34血管标记物染色，对照组较多个体出现胶原纤维和弹性纤维增生均明显，间质中大量新生血管形成，数量繁多，管径大小不等。实验组中个体纤维沉积较少，新生血管数量较对照组明显减少，管径相对较细（见图4）。

图4 CD34在贲门周围粘连组织中的表达（×400）

根据CD34在血管内皮细胞表达情况判定MVD，对照组MVD值为（14.47±2.89），实验组MVD值为（11.44±2.71），两者差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。对VEGF与MVD的直线相关性分析发现，两者呈正相关（r=0.539，P＜0.05），即VEGF高表达的组织MVD呈现高趋势（见表2）。

表2 VEGF及MVD在贲门周围粘连组织中的表达及其相关性

3 讨论

聚乳酸手术保护膜是一种特殊的可吸收材料，手术后在体内创面间使用该膜，可以减少创伤面之间的直接接触，防止纤维组织细胞相互侵入，最大限度防止组织间不良粘连形成，预防术后创面粘连再生及新生血管形成。本研究在门静脉高压大鼠贲门周围血管离断术中应用聚乳酸手术保护膜包绕贲门周围创面，观察术后贲门周围粘连及新生血管生成情况，发现实验组大鼠贲门周围组织粘连分级较对照组明显降低，新生血管数量较对照组明显减少，进而推断在临床门静脉高压患者贲门周围血管离断术中使用聚乳酸手术保护膜包绕食管中下段、胃底，预防门奇静脉侧支循环再建立，降低术后食管中下段、胃底静脉曲张破裂再出血的发生率的可能性。

贲门周围血管离断术是通过阻断门奇静脉间反常血流，达到控制门静脉高压症引起的食管胃底静脉曲张破裂出血，被推荐为外科治疗门静脉高压症首选的急诊手术方式。然而该术式对食管、胃底的广泛剥离会造成局部组织的粘连、新生血管形成，导致侧支循环再次开放，引起食管中下段、胃底静脉曲张破裂再出血［9］。Makdissi等［10］进行临床随访调查后发现，贲门周围血管离断术后，5 a内因食管中下段、胃底曲张静脉破裂再出血的患者，在所有术后上消化道出血患者的比例达54.2％。因此贲门周围血管离断术后，减少贲门周围组织粘连及新生血管形成，将对食管中下段、胃底静脉曲张再形成甚至破裂再出血将会产生一定预防作用。本实验中，实验组腹腔粘连宏观分级较对照组明显降低（P＜0.05），具体表现为实验组粘连范围小，所涉及的粘连组织、器官相对较少，说明聚乳酸手术保护膜可有效降低贲门周围血管离断术后贲门周围组织粘连形成。

大鼠贲门周围血管离断术后，在很多细胞、炎性因子、细胞因子、细胞外基质等相互作用后，最终形成贲门周围粘连组织，并伴随着组织新生血管形成。血管内皮生长因子（VEGF）是同源二聚体糖蛋白，有单一基因编码表达的，能够直接激发血管内皮细胞迁移、增殖及分裂、分化，并增加微小血管的通透性，是目前文献上公认较强、研究较成熟的一种促血管生长因子［11］。Rout等［12］研究发现，粘连组织中VEGF mRNA与VEGF蛋白较正常组织高表达，提示VEGF参与了粘连形成，VEGF在粘连组织中的表达与粘连程度存在相关性，随着粘连程度增加而表达增强。CD34在新生血管内皮细胞中的表达远远大于非新生血管内皮细胞，提示其作用可能与血管生成有关，是目前最敏感的新生血管内皮细胞标记物［13］。本实验应用 VEGF与CD34从组织学角度评估贲门周围粘连组织的粘连程度及新生血管情况。从免疫组织化学所呈现的结果看，两组个体均存在不同程度粘连，对照组大鼠贲门周围组织粘连较重，其VEGF表达明显高于实验组（P＜0.05），同时对照组新生血管数目较实验组明显增多（P＜0.05）。鉴于VEGF与血管生成的密切关系，我们同时研究了VEGF和MVD在粘连组织中的表达及相关性，VEGF高表达的对照组较低表达的实验组的MVD值明显增高，且差异具有统计学意义，两者存在正相关，从而提示粘连形成与血管发生之间存在密切关系，其可能通过VEGF的高表达而促进新生血管生成。

综上所述，根据本实验结果及相关研究，聚乳酸手术保护膜在一定程度上可以预防、减少门脉高压大鼠贲门周围血管离断术后粘连形成以及新生血管生成。由此推断，对于临床上门静脉高压患者，贲门周围血管离断术中应用聚乳酸手术保护膜包绕贲门周围创面，对于减少术后新生血管形成，进而减少侧支循环再开放，降低食管中下段及胃底静脉曲张破裂再出血的发生率可能具有一定的治疗效果。

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The application of polylactic acid operative protective film in the portal hypertension rat model of pericardial devascularization

CHEN Baoxing，XU Bing，ZHU Bingshuai

（Department of Hepatopancreatobiliary，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

Objective：To assess the effects of polylactic acid operative protective film in the portal hypertension ratmodel of pericardial devascularization.M ethods：40 SD rats were random ly divided into two groups，including the experimental group and the control group.The experimental group and the control group were made prehepatic portal hypertension model by partial portal vein ligation.The rats of experimental group underwent pericardial devascularization with polylactic acid operative protective film surrounding the cardia wound and the rats of control group were only operated by pericardial devascularization.Ratswere sacrificed after four weeks and specimens collected were made paraffin immunohistochem ical staining to observe the expression of CD34 and VEGF.Observe and analyse the cardiac peripheral tissue adhesion degree and neovascularizationthe.Resu lts：The control group had a wide range of adhesion in the macroscopic classification，while experimental group involved fewer adhesion and organs.The experimental group classification adhesion decreased significantly comparing with the control group and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Immunohistochemistry showed that the experimental group were lower than the control group in the degree of adhesion and angiogenesis of cases，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Polylactic acid operative protective film can prevent and reduce adhesion formation and angiogenesis in portal hypertension ratsmodel of pericardial devascularization in a certain extent.Polylactic acid operative protective film may be helpful to reduce rebleeding incidence in patients with portal hypertension after pericardial devascularization.

polylactic acid operative protective film；pericardial devascularization；VEGF；CD34

R 332

10.3969/j.issn.1004-437X2014.11.004

2014-06-30）

·临床研究·