RP—HPLC测定夏桑菊颗粒中迷迭香酸的含量

彭丽英+彭攸灵+杨先国

[摘要] 目的 建立夏桑菊颗粒中主要成分迷迭香酸的含量测定方法。 方法 采用高效液相色谱法对迷迭香酸进行含量测定，色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：0.8 ml/min，检测波长329 nm，柱温27℃，进样体积10 μl，流动相为甲醇-0.5%乙酸水系统梯度洗脱。 结果 含量测定中迷迭香酸进样在0.22～8.80 μg范围内，线性关系良好（r=0.9999），平均回收率和RSD均符合要求。 结论 所建立方法操作简单、专属性和重现性良好，可作为该制剂的质量控制方法之一。

[关键词] 夏桑菊颗粒；迷迭香酸；高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（b）-0008-03

夏桑菊颗粒是由夏枯草、桑叶、野菊花3味药材组成，具有清热解毒、清肝明目之功效，临床常用于风热感冒、目赤头痛、高血药等症，并可作为清凉饮料使用，商品规格20袋/包，10g/袋。夏桑菊颗粒收载于原卫生部标准（部颁标准）第15册，缺乏含量测定项[1]。夏桑菊颗粒的君药是夏枯草，2010年版《中国药典》修订了夏枯草的含量测定项，其含量测定指标修订为迷迭香酸[2]。迷迭香酸具有抗菌[3-5]、抗病毒[4]、抗氧化[6-7]、抗血栓[4，8]、保肝护肝[9]、抗炎活性[4，10-11]和免疫抑制活性[4]等作用。因此，本研究采用HPLC方法对夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的进行含量测定研究，为提高夏桑菊颗粒的质量控制标准提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

BPZ11D型电子分析天平（Sartorius公司）；KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；Waters 2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含自动进样器、四元梯度泵（美国，Waters公司）。

1.2 溶剂与试药

甲醇（色谱纯，TEDIA公司），水为哇哈哈纯净水；乙酸（分析纯，北京化工厂）。对照品迷迭香酸[12-13]（外标一点法测定纯度>98%）和样品夏桑菊颗粒及阴性制剂颗粒[14]，由湖南中医药大学药学院林丽美教授赠送，具体样品见含量测定项。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选择Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱；检测波长：329 nm；流速：0.8 ml/min；样品室温度：20℃；柱温：27℃；进样体积：10 μl；流动相：甲醇（A）-0.5%乙酸水（B）梯度洗脱，0→60 min，30%A→40%。按照上述色谱条件，迷迭香酸分离很好，无干扰，得色谱图1。

2.2 供试品溶液制备

称取夏桑菊颗粒、缺夏枯草的阴性制剂颗粒样品约5 g，精密称定，加甲醇10 ml，称重，超声（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，静置放凉，甲醇补重，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液进行HPLC分析。

2.3 标准曲线的绘制

精密称取对照品迷迭香酸适量，用甲醇溶解，定容得浓度为0.22 μg/μl的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1、2、3、5、10、15、20、25、30、40 μl进样分析，记录色谱条件下测得的峰面积。以峰面积作为纵坐标（Y），进样量（μg）作为横坐标（X），得回归方程：Y=4 541 216X-411 008（r=0.9999）；线性范围：0.22～8.80 μg。

2.4 精密度试验

取夏桑菊颗粒同一供试品（批号：FA10176），按照“2.2”项制备供试品溶液，分别精密吸取溶液10 μl，连续进样6次，按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积，其RSD=0.58%。

2.5 稳定性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品（批号：FA10176），按照“2.2”项制备供试品溶液，精密吸取溶液10 μl，分别在2、4、6、8、10、12、24 h进样，按上述色谱条件测定迷迭香酸的峰面积，其RSD=0.58%。

2.6 重复性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品（批号：FA10176）6份，精密称定，按照“2.2”项下制备供试品溶液，精密吸取每份溶液10 μl，按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积，其RSD=0.60%。

2.7 加样回收率试验

取同一批已知准确含量的夏桑菊颗粒样品（批号：FA10176）约2.5 g，精密称定，分别精密加入一定量的对照品迷迭香酸溶液，按“2.2”项制成加样的供试品溶液，按上述色谱条件测定迷迭香酸总量，计算加样回收率（表1）。

2.8 含量测定

按上述色谱条件，将不同厂家的样品进行平行处理和进样分析，每个样品称2份，每份样品平行进两针，测定迷迭香酸峰面积，计算夏桑菊颗粒中迷迭香酸的含量，得出平均值（表2）。

3 讨论

采用HPLC方法，建立夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的含量测定方法，该方法样品处理简单、容易、可控，所建立的色谱条件相对简单，单一梯度洗脱，适宜于大量夏桑菊颗粒样本中迷迭香酸的含量测定，具有很好的实用性。含量测定结果表明，夏桑菊颗粒样品中迷迭香酸的含量差别很大（0.20～7.04 mg），说明现在市面上流通的夏桑菊颗粒中质量参差不齐，建议夏桑菊颗粒增加含量测定项以进一步保证质量。

[参考文献]

[1] WS3-B-3019-98.中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂（15册）[S].

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：263.

[3] 孙峋，汪靖超，李洪涛，等.迷迭香酸的抗菌机理研究[J].青岛大学学报：自然科学版，2005，18（4）：41-45.

[4] 吴建章，郁建平，赵东亮.迷迭香酸的研究进展[J].天然产物研究与开发，2005，17（3）：383-388.

[5] 郭道森，杜桂彩，李丽，等.迷迭香酸对几种植物病原真菌的抗菌活性[J].微生物学通报，2004，31（4）：71-76.

[6] 吕晓玲，姚慧.迷迭香酸对猪油的抗氧化效果[J].中国油脂，2010，（9）：33-35.

[7] 丁巍，黄松明，张爱华，等.迷迭香酸对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏的抗氧化保护作用[J].南京医科大学学报：自然科学版，2009，29（3）：350-355.

[8] 邹正午，徐理纳.迷迭香酸抗血栓和抗血小板聚集作用[J].药学学报，1993，28（4）：241-245.

[9] 王虹，刘红梅，王磊.迷迭香酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中成药，2009，31（3）：354-358.

[10] 李丽，梁绪国，田京伟，等.迷迭香酸抗炎作用研究[J].中药药理与临床，2008，24（4）：21-22.

[11] 吕晓玲，马立强，孙明洁，等.迷迭香酸对小鼠炎症介质的影响[J].天津科技大学学报，2010，25（2）：5-8.

[12] 林丽美，许招懂，闫积彪，等.夏枯草中活性成分迷迭香酸的提取分离、结构鉴定与富集[J].中国实验方剂学杂志，2009，15（8）：35-38.

[13] 林丽美，许招懂，姚江雄，等.夏枯草中异迷迭香酸苷和迷迭香酸的含量测定[J].中国药学杂志，2012，47（15）：1204-1207.

[14] 林丽美，许招懂，姚江雄，等.夏桑菊质量标准研究[J].中成药，2012，34（8）：1500-1505.

（收稿日期：2014-04-13 本文编辑：林利利）

[摘要] 目的 建立夏桑菊颗粒中主要成分迷迭香酸的含量测定方法。 方法 采用高效液相色谱法对迷迭香酸进行含量测定，色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：0.8 ml/min，检测波长329 nm，柱温27℃，进样体积10 μl，流动相为甲醇-0.5%乙酸水系统梯度洗脱。 结果 含量测定中迷迭香酸进样在0.22～8.80 μg范围内，线性关系良好（r=0.9999），平均回收率和RSD均符合要求。 结论 所建立方法操作简单、专属性和重现性良好，可作为该制剂的质量控制方法之一。

[关键词] 夏桑菊颗粒；迷迭香酸；高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（b）-0008-03

夏桑菊颗粒是由夏枯草、桑叶、野菊花3味药材组成，具有清热解毒、清肝明目之功效，临床常用于风热感冒、目赤头痛、高血药等症，并可作为清凉饮料使用，商品规格20袋/包，10g/袋。夏桑菊颗粒收载于原卫生部标准（部颁标准）第15册，缺乏含量测定项[1]。夏桑菊颗粒的君药是夏枯草，2010年版《中国药典》修订了夏枯草的含量测定项，其含量测定指标修订为迷迭香酸[2]。迷迭香酸具有抗菌[3-5]、抗病毒[4]、抗氧化[6-7]、抗血栓[4，8]、保肝护肝[9]、抗炎活性[4，10-11]和免疫抑制活性[4]等作用。因此，本研究采用HPLC方法对夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的进行含量测定研究，为提高夏桑菊颗粒的质量控制标准提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

BPZ11D型电子分析天平（Sartorius公司）；KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；Waters 2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含自动进样器、四元梯度泵（美国，Waters公司）。

1.2 溶剂与试药

甲醇（色谱纯，TEDIA公司），水为哇哈哈纯净水；乙酸（分析纯，北京化工厂）。对照品迷迭香酸[12-13]（外标一点法测定纯度>98%）和样品夏桑菊颗粒及阴性制剂颗粒[14]，由湖南中医药大学药学院林丽美教授赠送，具体样品见含量测定项。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选择Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱；检测波长：329 nm；流速：0.8 ml/min；样品室温度：20℃；柱温：27℃；进样体积：10 μl；流动相：甲醇（A）-0.5%乙酸水（B）梯度洗脱，0→60 min，30%A→40%。按照上述色谱条件，迷迭香酸分离很好，无干扰，得色谱图1。

2.2 供试品溶液制备

称取夏桑菊颗粒、缺夏枯草的阴性制剂颗粒样品约5 g，精密称定，加甲醇10 ml，称重，超声（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，静置放凉，甲醇补重，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液进行HPLC分析。

2.3 标准曲线的绘制

精密称取对照品迷迭香酸适量，用甲醇溶解，定容得浓度为0.22 μg/μl的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1、2、3、5、10、15、20、25、30、40 μl进样分析，记录色谱条件下测得的峰面积。以峰面积作为纵坐标（Y），进样量（μg）作为横坐标（X），得回归方程：Y=4 541 216X-411 008（r=0.9999）；线性范围：0.22～8.80 μg。

2.4 精密度试验

取夏桑菊颗粒同一供试品（批号：FA10176），按照“2.2”项制备供试品溶液，分别精密吸取溶液10 μl，连续进样6次，按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积，其RSD=0.58%。

2.5 稳定性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品（批号：FA10176），按照“2.2”项制备供试品溶液，精密吸取溶液10 μl，分别在2、4、6、8、10、12、24 h进样，按上述色谱条件测定迷迭香酸的峰面积，其RSD=0.58%。

2.6 重复性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品（批号：FA10176）6份，精密称定，按照“2.2”项下制备供试品溶液，精密吸取每份溶液10 μl，按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积，其RSD=0.60%。

2.7 加样回收率试验

取同一批已知准确含量的夏桑菊颗粒样品（批号：FA10176）约2.5 g，精密称定，分别精密加入一定量的对照品迷迭香酸溶液，按“2.2”项制成加样的供试品溶液，按上述色谱条件测定迷迭香酸总量，计算加样回收率（表1）。

2.8 含量测定

按上述色谱条件，将不同厂家的样品进行平行处理和进样分析，每个样品称2份，每份样品平行进两针，测定迷迭香酸峰面积，计算夏桑菊颗粒中迷迭香酸的含量，得出平均值（表2）。

3 讨论

采用HPLC方法，建立夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的含量测定方法，该方法样品处理简单、容易、可控，所建立的色谱条件相对简单，单一梯度洗脱，适宜于大量夏桑菊颗粒样本中迷迭香酸的含量测定，具有很好的实用性。含量测定结果表明，夏桑菊颗粒样品中迷迭香酸的含量差别很大（0.20～7.04 mg），说明现在市面上流通的夏桑菊颗粒中质量参差不齐，建议夏桑菊颗粒增加含量测定项以进一步保证质量。

[参考文献]

[1] WS3-B-3019-98.中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂（15册）[S].

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：263.

[3] 孙峋，汪靖超，李洪涛，等.迷迭香酸的抗菌机理研究[J].青岛大学学报：自然科学版，2005，18（4）：41-45.

[4] 吴建章，郁建平，赵东亮.迷迭香酸的研究进展[J].天然产物研究与开发，2005，17（3）：383-388.

[5] 郭道森，杜桂彩，李丽，等.迷迭香酸对几种植物病原真菌的抗菌活性[J].微生物学通报，2004，31（4）：71-76.

[6] 吕晓玲，姚慧.迷迭香酸对猪油的抗氧化效果[J].中国油脂，2010，（9）：33-35.

[7] 丁巍，黄松明，张爱华，等.迷迭香酸对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏的抗氧化保护作用[J].南京医科大学学报：自然科学版，2009，29（3）：350-355.

[8] 邹正午，徐理纳.迷迭香酸抗血栓和抗血小板聚集作用[J].药学学报，1993，28（4）：241-245.

[9] 王虹，刘红梅，王磊.迷迭香酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中成药，2009，31（3）：354-358.

[10] 李丽，梁绪国，田京伟，等.迷迭香酸抗炎作用研究[J].中药药理与临床，2008，24（4）：21-22.

[11] 吕晓玲，马立强，孙明洁，等.迷迭香酸对小鼠炎症介质的影响[J].天津科技大学学报，2010，25（2）：5-8.

[12] 林丽美，许招懂，闫积彪，等.夏枯草中活性成分迷迭香酸的提取分离、结构鉴定与富集[J].中国实验方剂学杂志，2009，15（8）：35-38.

[13] 林丽美，许招懂，姚江雄，等.夏枯草中异迷迭香酸苷和迷迭香酸的含量测定[J].中国药学杂志，2012，47（15）：1204-1207.

[14] 林丽美，许招懂，姚江雄，等.夏桑菊质量标准研究[J].中成药，2012，34（8）：1500-1505.

（收稿日期：2014-04-13 本文编辑：林利利）

[摘要] 目的 建立夏桑菊颗粒中主要成分迷迭香酸的含量测定方法。 方法 采用高效液相色谱法对迷迭香酸进行含量测定，色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：0.8 ml/min，检测波长329 nm，柱温27℃，进样体积10 μl，流动相为甲醇-0.5%乙酸水系统梯度洗脱。 结果 含量测定中迷迭香酸进样在0.22～8.80 μg范围内，线性关系良好（r=0.9999），平均回收率和RSD均符合要求。 结论 所建立方法操作简单、专属性和重现性良好，可作为该制剂的质量控制方法之一。

[关键词] 夏桑菊颗粒；迷迭香酸；高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（b）-0008-03

夏桑菊颗粒是由夏枯草、桑叶、野菊花3味药材组成，具有清热解毒、清肝明目之功效，临床常用于风热感冒、目赤头痛、高血药等症，并可作为清凉饮料使用，商品规格20袋/包，10g/袋。夏桑菊颗粒收载于原卫生部标准（部颁标准）第15册，缺乏含量测定项[1]。夏桑菊颗粒的君药是夏枯草，2010年版《中国药典》修订了夏枯草的含量测定项，其含量测定指标修订为迷迭香酸[2]。迷迭香酸具有抗菌[3-5]、抗病毒[4]、抗氧化[6-7]、抗血栓[4，8]、保肝护肝[9]、抗炎活性[4，10-11]和免疫抑制活性[4]等作用。因此，本研究采用HPLC方法对夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的进行含量测定研究，为提高夏桑菊颗粒的质量控制标准提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

BPZ11D型电子分析天平（Sartorius公司）；KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；Waters 2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含自动进样器、四元梯度泵（美国，Waters公司）。

1.2 溶剂与试药

甲醇（色谱纯，TEDIA公司），水为哇哈哈纯净水；乙酸（分析纯，北京化工厂）。对照品迷迭香酸[12-13]（外标一点法测定纯度>98%）和样品夏桑菊颗粒及阴性制剂颗粒[14]，由湖南中医药大学药学院林丽美教授赠送，具体样品见含量测定项。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选择Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱；检测波长：329 nm；流速：0.8 ml/min；样品室温度：20℃；柱温：27℃；进样体积：10 μl；流动相：甲醇（A）-0.5%乙酸水（B）梯度洗脱，0→60 min，30%A→40%。按照上述色谱条件，迷迭香酸分离很好，无干扰，得色谱图1。

2.2 供试品溶液制备

称取夏桑菊颗粒、缺夏枯草的阴性制剂颗粒样品约5 g，精密称定，加甲醇10 ml，称重，超声（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，静置放凉，甲醇补重，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液进行HPLC分析。

2.3 标准曲线的绘制

精密称取对照品迷迭香酸适量，用甲醇溶解，定容得浓度为0.22 μg/μl的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1、2、3、5、10、15、20、25、30、40 μl进样分析，记录色谱条件下测得的峰面积。以峰面积作为纵坐标（Y），进样量（μg）作为横坐标（X），得回归方程：Y=4 541 216X-411 008（r=0.9999）；线性范围：0.22～8.80 μg。

2.4 精密度试验

取夏桑菊颗粒同一供试品（批号：FA10176），按照“2.2”项制备供试品溶液，分别精密吸取溶液10 μl，连续进样6次，按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积，其RSD=0.58%。

2.5 稳定性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品（批号：FA10176），按照“2.2”项制备供试品溶液，精密吸取溶液10 μl，分别在2、4、6、8、10、12、24 h进样，按上述色谱条件测定迷迭香酸的峰面积，其RSD=0.58%。

2.6 重复性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品（批号：FA10176）6份，精密称定，按照“2.2”项下制备供试品溶液，精密吸取每份溶液10 μl，按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积，其RSD=0.60%。

2.7 加样回收率试验

取同一批已知准确含量的夏桑菊颗粒样品（批号：FA10176）约2.5 g，精密称定，分别精密加入一定量的对照品迷迭香酸溶液，按“2.2”项制成加样的供试品溶液，按上述色谱条件测定迷迭香酸总量，计算加样回收率（表1）。

2.8 含量测定

按上述色谱条件，将不同厂家的样品进行平行处理和进样分析，每个样品称2份，每份样品平行进两针，测定迷迭香酸峰面积，计算夏桑菊颗粒中迷迭香酸的含量，得出平均值（表2）。

3 讨论

采用HPLC方法，建立夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的含量测定方法，该方法样品处理简单、容易、可控，所建立的色谱条件相对简单，单一梯度洗脱，适宜于大量夏桑菊颗粒样本中迷迭香酸的含量测定，具有很好的实用性。含量测定结果表明，夏桑菊颗粒样品中迷迭香酸的含量差别很大（0.20～7.04 mg），说明现在市面上流通的夏桑菊颗粒中质量参差不齐，建议夏桑菊颗粒增加含量测定项以进一步保证质量。

[参考文献]

[1] WS3-B-3019-98.中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂（15册）[S].

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：263.

[3] 孙峋，汪靖超，李洪涛，等.迷迭香酸的抗菌机理研究[J].青岛大学学报：自然科学版，2005，18（4）：41-45.

[4] 吴建章，郁建平，赵东亮.迷迭香酸的研究进展[J].天然产物研究与开发，2005，17（3）：383-388.

[5] 郭道森，杜桂彩，李丽，等.迷迭香酸对几种植物病原真菌的抗菌活性[J].微生物学通报，2004，31（4）：71-76.

[6] 吕晓玲，姚慧.迷迭香酸对猪油的抗氧化效果[J].中国油脂，2010，（9）：33-35.

[7] 丁巍，黄松明，张爱华，等.迷迭香酸对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏的抗氧化保护作用[J].南京医科大学学报：自然科学版，2009，29（3）：350-355.

[8] 邹正午，徐理纳.迷迭香酸抗血栓和抗血小板聚集作用[J].药学学报，1993，28（4）：241-245.

[9] 王虹，刘红梅，王磊.迷迭香酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中成药，2009，31（3）：354-358.

[10] 李丽，梁绪国，田京伟，等.迷迭香酸抗炎作用研究[J].中药药理与临床，2008，24（4）：21-22.

[11] 吕晓玲，马立强，孙明洁，等.迷迭香酸对小鼠炎症介质的影响[J].天津科技大学学报，2010，25（2）：5-8.

[12] 林丽美，许招懂，闫积彪，等.夏枯草中活性成分迷迭香酸的提取分离、结构鉴定与富集[J].中国实验方剂学杂志，2009，15（8）：35-38.

[13] 林丽美，许招懂，姚江雄，等.夏枯草中异迷迭香酸苷和迷迭香酸的含量测定[J].中国药学杂志，2012，47（15）：1204-1207.

[14] 林丽美，许招懂，姚江雄，等.夏桑菊质量标准研究[J].中成药，2012，34（8）：1500-1505.

（收稿日期：2014-04-13 本文编辑：林利利）