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RP—HPLC测定夏桑菊颗粒中迷迭香酸的含量

2014-09-03彭丽英彭攸灵杨先国

中国当代医药 2014年20期
关键词:高效液相色谱法

彭丽英+彭攸灵+杨先国

[摘要] 目的 建立夏桑菊颗粒中主要成分迷迭香酸的含量测定方法。 方法 采用高效液相色谱法对迷迭香酸进行含量测定,色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速:0.8 ml/min,检测波长329 nm,柱温27℃,进样体积10 μl,流动相为甲醇-0.5%乙酸水系统梯度洗脱。 结果 含量测定中迷迭香酸进样在0.22~8.80 μg范围内,线性关系良好(r=0.9999),平均回收率和RSD均符合要求。 结论 所建立方法操作简单、专属性和重现性良好,可作为该制剂的质量控制方法之一。

[关键词] 夏桑菊颗粒;迷迭香酸;高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2014)07(b)-0008-03

夏桑菊颗粒是由夏枯草、桑叶、野菊花3味药材组成,具有清热解毒、清肝明目之功效,临床常用于风热感冒、目赤头痛、高血药等症,并可作为清凉饮料使用,商品规格20袋/包,10g/袋。夏桑菊颗粒收载于原卫生部标准(部颁标准)第15册,缺乏含量测定项[1]。夏桑菊颗粒的君药是夏枯草,2010年版《中国药典》修订了夏枯草的含量测定项,其含量测定指标修订为迷迭香酸[2]。迷迭香酸具有抗菌[3-5]、抗病毒[4]、抗氧化[6-7]、抗血栓[4,8]、保肝护肝[9]、抗炎活性[4,10-11]和免疫抑制活性[4]等作用。因此,本研究采用HPLC方法对夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的进行含量测定研究,为提高夏桑菊颗粒的质量控制标准提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

BPZ11D型电子分析天平(Sartorius公司);KQ-100B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);Waters 2695-2996高效液相色谱系统,Empower工作站,含自动进样器、四元梯度泵(美国,Waters公司)。

1.2 溶剂与试药

甲醇(色谱纯,TEDIA公司),水为哇哈哈纯净水;乙酸(分析纯,北京化工厂)。对照品迷迭香酸[12-13](外标一点法测定纯度>98%)和样品夏桑菊颗粒及阴性制剂颗粒[14],由湖南中医药大学药学院林丽美教授赠送,具体样品见含量测定项。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选择Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱;检测波长:329 nm;流速:0.8 ml/min;样品室温度:20℃;柱温:27℃;进样体积:10 μl;流动相:甲醇(A)-0.5%乙酸水(B)梯度洗脱,0→60 min,30%A→40%。按照上述色谱条件,迷迭香酸分离很好,无干扰,得色谱图1。

2.2 供试品溶液制备

称取夏桑菊颗粒、缺夏枯草的阴性制剂颗粒样品约5 g,精密称定,加甲醇10 ml,称重,超声(功率250 W,频率40 kHz)30 min,取出,静置放凉,甲醇补重,0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液进行HPLC分析。

2.3 标准曲线的绘制

精密称取对照品迷迭香酸适量,用甲醇溶解,定容得浓度为0.22 μg/μl的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1、2、3、5、10、15、20、25、30、40 μl进样分析,记录色谱条件下测得的峰面积。以峰面积作为纵坐标(Y),进样量(μg)作为横坐标(X),得回归方程:Y=4 541 216X-411 008(r=0.9999);线性范围:0.22~8.80 μg。

2.4 精密度试验

取夏桑菊颗粒同一供试品(批号:FA10176),按照“2.2”项制备供试品溶液,分别精密吸取溶液10 μl,连续进样6次,按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积,其RSD=0.58%。

2.5 稳定性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品(批号:FA10176),按照“2.2”项制备供试品溶液,精密吸取溶液10 μl,分别在2、4、6、8、10、12、24 h进样,按上述色谱条件测定迷迭香酸的峰面积,其RSD=0.58%。

2.6 重复性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品(批号:FA10176)6份,精密称定,按照“2.2”项下制备供试品溶液,精密吸取每份溶液10 μl,按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积,其RSD=0.60%。

2.7 加样回收率试验

取同一批已知准确含量的夏桑菊颗粒样品(批号:FA10176)约2.5 g,精密称定,分别精密加入一定量的对照品迷迭香酸溶液,按“2.2”项制成加样的供试品溶液,按上述色谱条件测定迷迭香酸总量,计算加样回收率(表1)。

2.8 含量测定

按上述色谱条件,将不同厂家的样品进行平行处理和进样分析,每个样品称2份,每份样品平行进两针,测定迷迭香酸峰面积,计算夏桑菊颗粒中迷迭香酸的含量,得出平均值(表2)。

3 讨论

采用HPLC方法,建立夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的含量测定方法,该方法样品处理简单、容易、可控,所建立的色谱条件相对简单,单一梯度洗脱,适宜于大量夏桑菊颗粒样本中迷迭香酸的含量测定,具有很好的实用性。含量测定结果表明,夏桑菊颗粒样品中迷迭香酸的含量差别很大(0.20~7.04 mg),说明现在市面上流通的夏桑菊颗粒中质量参差不齐,建议夏桑菊颗粒增加含量测定项以进一步保证质量。

[参考文献]

[1] WS3-B-3019-98.中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂(15册)[S].

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010:263.

[3] 孙峋,汪靖超,李洪涛,等.迷迭香酸的抗菌机理研究[J].青岛大学学报:自然科学版,2005,18(4):41-45.

[4] 吴建章,郁建平,赵东亮.迷迭香酸的研究进展[J].天然产物研究与开发,2005,17(3):383-388.

[5] 郭道森,杜桂彩,李丽,等.迷迭香酸对几种植物病原真菌的抗菌活性[J].微生物学通报,2004,31(4):71-76.

[6] 吕晓玲,姚慧.迷迭香酸对猪油的抗氧化效果[J].中国油脂,2010,(9):33-35.

[7] 丁巍,黄松明,张爱华,等.迷迭香酸对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏的抗氧化保护作用[J].南京医科大学学报:自然科学版,2009,29(3):350-355.

[8] 邹正午,徐理纳.迷迭香酸抗血栓和抗血小板聚集作用[J].药学学报,1993,28(4):241-245.

[9] 王虹,刘红梅,王磊.迷迭香酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中成药,2009,31(3):354-358.

[10] 李丽,梁绪国,田京伟,等.迷迭香酸抗炎作用研究[J].中药药理与临床,2008,24(4):21-22.

[11] 吕晓玲,马立强,孙明洁,等.迷迭香酸对小鼠炎症介质的影响[J].天津科技大学学报,2010,25(2):5-8.

[12] 林丽美,许招懂,闫积彪,等.夏枯草中活性成分迷迭香酸的提取分离、结构鉴定与富集[J].中国实验方剂学杂志,2009,15(8):35-38.

[13] 林丽美,许招懂,姚江雄,等.夏枯草中异迷迭香酸苷和迷迭香酸的含量测定[J].中国药学杂志,2012,47(15):1204-1207.

[14] 林丽美,许招懂,姚江雄,等.夏桑菊质量标准研究[J].中成药,2012,34(8):1500-1505.

(收稿日期:2014-04-13 本文编辑:林利利)

[摘要] 目的 建立夏桑菊颗粒中主要成分迷迭香酸的含量测定方法。 方法 采用高效液相色谱法对迷迭香酸进行含量测定,色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速:0.8 ml/min,检测波长329 nm,柱温27℃,进样体积10 μl,流动相为甲醇-0.5%乙酸水系统梯度洗脱。 结果 含量测定中迷迭香酸进样在0.22~8.80 μg范围内,线性关系良好(r=0.9999),平均回收率和RSD均符合要求。 结论 所建立方法操作简单、专属性和重现性良好,可作为该制剂的质量控制方法之一。

[关键词] 夏桑菊颗粒;迷迭香酸;高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2014)07(b)-0008-03

夏桑菊颗粒是由夏枯草、桑叶、野菊花3味药材组成,具有清热解毒、清肝明目之功效,临床常用于风热感冒、目赤头痛、高血药等症,并可作为清凉饮料使用,商品规格20袋/包,10g/袋。夏桑菊颗粒收载于原卫生部标准(部颁标准)第15册,缺乏含量测定项[1]。夏桑菊颗粒的君药是夏枯草,2010年版《中国药典》修订了夏枯草的含量测定项,其含量测定指标修订为迷迭香酸[2]。迷迭香酸具有抗菌[3-5]、抗病毒[4]、抗氧化[6-7]、抗血栓[4,8]、保肝护肝[9]、抗炎活性[4,10-11]和免疫抑制活性[4]等作用。因此,本研究采用HPLC方法对夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的进行含量测定研究,为提高夏桑菊颗粒的质量控制标准提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

BPZ11D型电子分析天平(Sartorius公司);KQ-100B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);Waters 2695-2996高效液相色谱系统,Empower工作站,含自动进样器、四元梯度泵(美国,Waters公司)。

1.2 溶剂与试药

甲醇(色谱纯,TEDIA公司),水为哇哈哈纯净水;乙酸(分析纯,北京化工厂)。对照品迷迭香酸[12-13](外标一点法测定纯度>98%)和样品夏桑菊颗粒及阴性制剂颗粒[14],由湖南中医药大学药学院林丽美教授赠送,具体样品见含量测定项。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选择Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱;检测波长:329 nm;流速:0.8 ml/min;样品室温度:20℃;柱温:27℃;进样体积:10 μl;流动相:甲醇(A)-0.5%乙酸水(B)梯度洗脱,0→60 min,30%A→40%。按照上述色谱条件,迷迭香酸分离很好,无干扰,得色谱图1。

2.2 供试品溶液制备

称取夏桑菊颗粒、缺夏枯草的阴性制剂颗粒样品约5 g,精密称定,加甲醇10 ml,称重,超声(功率250 W,频率40 kHz)30 min,取出,静置放凉,甲醇补重,0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液进行HPLC分析。

2.3 标准曲线的绘制

精密称取对照品迷迭香酸适量,用甲醇溶解,定容得浓度为0.22 μg/μl的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1、2、3、5、10、15、20、25、30、40 μl进样分析,记录色谱条件下测得的峰面积。以峰面积作为纵坐标(Y),进样量(μg)作为横坐标(X),得回归方程:Y=4 541 216X-411 008(r=0.9999);线性范围:0.22~8.80 μg。

2.4 精密度试验

取夏桑菊颗粒同一供试品(批号:FA10176),按照“2.2”项制备供试品溶液,分别精密吸取溶液10 μl,连续进样6次,按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积,其RSD=0.58%。

2.5 稳定性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品(批号:FA10176),按照“2.2”项制备供试品溶液,精密吸取溶液10 μl,分别在2、4、6、8、10、12、24 h进样,按上述色谱条件测定迷迭香酸的峰面积,其RSD=0.58%。

2.6 重复性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品(批号:FA10176)6份,精密称定,按照“2.2”项下制备供试品溶液,精密吸取每份溶液10 μl,按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积,其RSD=0.60%。

2.7 加样回收率试验

取同一批已知准确含量的夏桑菊颗粒样品(批号:FA10176)约2.5 g,精密称定,分别精密加入一定量的对照品迷迭香酸溶液,按“2.2”项制成加样的供试品溶液,按上述色谱条件测定迷迭香酸总量,计算加样回收率(表1)。

2.8 含量测定

按上述色谱条件,将不同厂家的样品进行平行处理和进样分析,每个样品称2份,每份样品平行进两针,测定迷迭香酸峰面积,计算夏桑菊颗粒中迷迭香酸的含量,得出平均值(表2)。

3 讨论

采用HPLC方法,建立夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的含量测定方法,该方法样品处理简单、容易、可控,所建立的色谱条件相对简单,单一梯度洗脱,适宜于大量夏桑菊颗粒样本中迷迭香酸的含量测定,具有很好的实用性。含量测定结果表明,夏桑菊颗粒样品中迷迭香酸的含量差别很大(0.20~7.04 mg),说明现在市面上流通的夏桑菊颗粒中质量参差不齐,建议夏桑菊颗粒增加含量测定项以进一步保证质量。

[参考文献]

[1] WS3-B-3019-98.中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂(15册)[S].

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010:263.

[3] 孙峋,汪靖超,李洪涛,等.迷迭香酸的抗菌机理研究[J].青岛大学学报:自然科学版,2005,18(4):41-45.

[4] 吴建章,郁建平,赵东亮.迷迭香酸的研究进展[J].天然产物研究与开发,2005,17(3):383-388.

[5] 郭道森,杜桂彩,李丽,等.迷迭香酸对几种植物病原真菌的抗菌活性[J].微生物学通报,2004,31(4):71-76.

[6] 吕晓玲,姚慧.迷迭香酸对猪油的抗氧化效果[J].中国油脂,2010,(9):33-35.

[7] 丁巍,黄松明,张爱华,等.迷迭香酸对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏的抗氧化保护作用[J].南京医科大学学报:自然科学版,2009,29(3):350-355.

[8] 邹正午,徐理纳.迷迭香酸抗血栓和抗血小板聚集作用[J].药学学报,1993,28(4):241-245.

[9] 王虹,刘红梅,王磊.迷迭香酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中成药,2009,31(3):354-358.

[10] 李丽,梁绪国,田京伟,等.迷迭香酸抗炎作用研究[J].中药药理与临床,2008,24(4):21-22.

[11] 吕晓玲,马立强,孙明洁,等.迷迭香酸对小鼠炎症介质的影响[J].天津科技大学学报,2010,25(2):5-8.

[12] 林丽美,许招懂,闫积彪,等.夏枯草中活性成分迷迭香酸的提取分离、结构鉴定与富集[J].中国实验方剂学杂志,2009,15(8):35-38.

[13] 林丽美,许招懂,姚江雄,等.夏枯草中异迷迭香酸苷和迷迭香酸的含量测定[J].中国药学杂志,2012,47(15):1204-1207.

[14] 林丽美,许招懂,姚江雄,等.夏桑菊质量标准研究[J].中成药,2012,34(8):1500-1505.

(收稿日期:2014-04-13 本文编辑:林利利)

[摘要] 目的 建立夏桑菊颗粒中主要成分迷迭香酸的含量测定方法。 方法 采用高效液相色谱法对迷迭香酸进行含量测定,色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速:0.8 ml/min,检测波长329 nm,柱温27℃,进样体积10 μl,流动相为甲醇-0.5%乙酸水系统梯度洗脱。 结果 含量测定中迷迭香酸进样在0.22~8.80 μg范围内,线性关系良好(r=0.9999),平均回收率和RSD均符合要求。 结论 所建立方法操作简单、专属性和重现性良好,可作为该制剂的质量控制方法之一。

[关键词] 夏桑菊颗粒;迷迭香酸;高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2014)07(b)-0008-03

夏桑菊颗粒是由夏枯草、桑叶、野菊花3味药材组成,具有清热解毒、清肝明目之功效,临床常用于风热感冒、目赤头痛、高血药等症,并可作为清凉饮料使用,商品规格20袋/包,10g/袋。夏桑菊颗粒收载于原卫生部标准(部颁标准)第15册,缺乏含量测定项[1]。夏桑菊颗粒的君药是夏枯草,2010年版《中国药典》修订了夏枯草的含量测定项,其含量测定指标修订为迷迭香酸[2]。迷迭香酸具有抗菌[3-5]、抗病毒[4]、抗氧化[6-7]、抗血栓[4,8]、保肝护肝[9]、抗炎活性[4,10-11]和免疫抑制活性[4]等作用。因此,本研究采用HPLC方法对夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的进行含量测定研究,为提高夏桑菊颗粒的质量控制标准提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

BPZ11D型电子分析天平(Sartorius公司);KQ-100B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);Waters 2695-2996高效液相色谱系统,Empower工作站,含自动进样器、四元梯度泵(美国,Waters公司)。

1.2 溶剂与试药

甲醇(色谱纯,TEDIA公司),水为哇哈哈纯净水;乙酸(分析纯,北京化工厂)。对照品迷迭香酸[12-13](外标一点法测定纯度>98%)和样品夏桑菊颗粒及阴性制剂颗粒[14],由湖南中医药大学药学院林丽美教授赠送,具体样品见含量测定项。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选择Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱;检测波长:329 nm;流速:0.8 ml/min;样品室温度:20℃;柱温:27℃;进样体积:10 μl;流动相:甲醇(A)-0.5%乙酸水(B)梯度洗脱,0→60 min,30%A→40%。按照上述色谱条件,迷迭香酸分离很好,无干扰,得色谱图1。

2.2 供试品溶液制备

称取夏桑菊颗粒、缺夏枯草的阴性制剂颗粒样品约5 g,精密称定,加甲醇10 ml,称重,超声(功率250 W,频率40 kHz)30 min,取出,静置放凉,甲醇补重,0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液进行HPLC分析。

2.3 标准曲线的绘制

精密称取对照品迷迭香酸适量,用甲醇溶解,定容得浓度为0.22 μg/μl的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1、2、3、5、10、15、20、25、30、40 μl进样分析,记录色谱条件下测得的峰面积。以峰面积作为纵坐标(Y),进样量(μg)作为横坐标(X),得回归方程:Y=4 541 216X-411 008(r=0.9999);线性范围:0.22~8.80 μg。

2.4 精密度试验

取夏桑菊颗粒同一供试品(批号:FA10176),按照“2.2”项制备供试品溶液,分别精密吸取溶液10 μl,连续进样6次,按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积,其RSD=0.58%。

2.5 稳定性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品(批号:FA10176),按照“2.2”项制备供试品溶液,精密吸取溶液10 μl,分别在2、4、6、8、10、12、24 h进样,按上述色谱条件测定迷迭香酸的峰面积,其RSD=0.58%。

2.6 重复性试验

取夏桑菊颗粒同一供试品(批号:FA10176)6份,精密称定,按照“2.2”项下制备供试品溶液,精密吸取每份溶液10 μl,按上述色谱条件测得迷迭香酸峰面积,其RSD=0.60%。

2.7 加样回收率试验

取同一批已知准确含量的夏桑菊颗粒样品(批号:FA10176)约2.5 g,精密称定,分别精密加入一定量的对照品迷迭香酸溶液,按“2.2”项制成加样的供试品溶液,按上述色谱条件测定迷迭香酸总量,计算加样回收率(表1)。

2.8 含量测定

按上述色谱条件,将不同厂家的样品进行平行处理和进样分析,每个样品称2份,每份样品平行进两针,测定迷迭香酸峰面积,计算夏桑菊颗粒中迷迭香酸的含量,得出平均值(表2)。

3 讨论

采用HPLC方法,建立夏桑菊颗粒中主要活性成分迷迭香酸的含量测定方法,该方法样品处理简单、容易、可控,所建立的色谱条件相对简单,单一梯度洗脱,适宜于大量夏桑菊颗粒样本中迷迭香酸的含量测定,具有很好的实用性。含量测定结果表明,夏桑菊颗粒样品中迷迭香酸的含量差别很大(0.20~7.04 mg),说明现在市面上流通的夏桑菊颗粒中质量参差不齐,建议夏桑菊颗粒增加含量测定项以进一步保证质量。

[参考文献]

[1] WS3-B-3019-98.中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂(15册)[S].

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010:263.

[3] 孙峋,汪靖超,李洪涛,等.迷迭香酸的抗菌机理研究[J].青岛大学学报:自然科学版,2005,18(4):41-45.

[4] 吴建章,郁建平,赵东亮.迷迭香酸的研究进展[J].天然产物研究与开发,2005,17(3):383-388.

[5] 郭道森,杜桂彩,李丽,等.迷迭香酸对几种植物病原真菌的抗菌活性[J].微生物学通报,2004,31(4):71-76.

[6] 吕晓玲,姚慧.迷迭香酸对猪油的抗氧化效果[J].中国油脂,2010,(9):33-35.

[7] 丁巍,黄松明,张爱华,等.迷迭香酸对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏的抗氧化保护作用[J].南京医科大学学报:自然科学版,2009,29(3):350-355.

[8] 邹正午,徐理纳.迷迭香酸抗血栓和抗血小板聚集作用[J].药学学报,1993,28(4):241-245.

[9] 王虹,刘红梅,王磊.迷迭香酸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中成药,2009,31(3):354-358.

[10] 李丽,梁绪国,田京伟,等.迷迭香酸抗炎作用研究[J].中药药理与临床,2008,24(4):21-22.

[11] 吕晓玲,马立强,孙明洁,等.迷迭香酸对小鼠炎症介质的影响[J].天津科技大学学报,2010,25(2):5-8.

[12] 林丽美,许招懂,闫积彪,等.夏枯草中活性成分迷迭香酸的提取分离、结构鉴定与富集[J].中国实验方剂学杂志,2009,15(8):35-38.

[13] 林丽美,许招懂,姚江雄,等.夏枯草中异迷迭香酸苷和迷迭香酸的含量测定[J].中国药学杂志,2012,47(15):1204-1207.

[14] 林丽美,许招懂,姚江雄,等.夏桑菊质量标准研究[J].中成药,2012,34(8):1500-1505.

(收稿日期:2014-04-13 本文编辑:林利利)

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