超临界CO2提取经前方挥发油及其化学成分药理分析

方 玲，代 娜，刘欣宇，李爱主

(天津中医药大学，天津 300193)

经前方为临床上治疗原发性痛经的经验方，主要包括当归、川芎、小茴香、赤芍、玫瑰花等5味药材。其中当归、川芎、小茴香3味药的挥发油有效药效成分均对治疗痛经起着不同程度的作用。当归能活血止痛，其挥发油中的藁本内酯是血管平滑肌解痉作用的主要活性成分[1-2]。川芎主要的功能为活血止痛，常用于治疗月经不调，其挥发油同样具有镇痛、解痉的生物活性[3]。小茴香的挥发油成分反式茴香脑具有抗溃疡、镇痛、抗癌的药理作用[4-5]。超临界CO2萃取技术是一种新兴的提取分离技术,其与水蒸气蒸馏提取法比较提取率高、生产周期短、不易造成污染[6]。关于单味药材中挥发油提取的方法有很多报道，但对于各组方配伍后的挥发油成分提取确未曾报道。

本实验针对组方中当归、川芎、小茴香3味药配伍后的挥发油成分进行提取，采用气质联用的分析方法对组方中挥发性成分进行初步分析。并且采用缩宫素所导致的小鼠痛经扭体实验和镇痛实验来对挥发油的药效学基础进行进一步研究。进一步阐明化学有效成分和临床应用间的关系，为此组方的后续研究提供参考依据。

1 仪器与材料

中药经前方组方：当归、川芎、小茴香(药材均购于天津医药集团敬一堂)；无水硫酸钠、乙酸乙酯、阿司匹林肠溶片、缩宫素注射液、苯甲酸雌二醇注射液、前列腺素、吐温-80均来自天津伯尼尔有限公司。HA220-50-06超临界萃取装置；气相色谱质谱联用仪GCMS-Q2010SE(日本岛津)；高速万能粉碎机；TG328B型电子分析天平；离心机；移液枪，电热套，烧瓶，挥发油提取器，容量瓶，量筒等仪器均取自天津中医药大学实验室。小鼠(昆明种)共计88只，约重为20 g;SD大鼠10只，每只约重200 g，购买于中国医学科学院放射医学研究所。

2 方法与结果

2.1 经前方中挥发油的超临界CO2法提取 取当归、川芎、小茴香按比例混合，粉碎(40目)，取适量加入提取釜中，提取条件：萃取压力为20 MPa，萃取温度为40 ℃，分离Ⅰ室的温度为45 ℃，分离Ⅱ室为室温，2个分离室之间的压力差为0，物料重量为2 kg。

2.2 经前方挥发油提取物GC-MS分析 GC-MC检测条件:毛细管柱规格为30 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升温法，设置初温60 ℃,保留3 min后，以5 ℃/min由初始温度升至110 ℃，保留2 min后,以10 ℃/min的速率再次升温至280 ℃，并且保留3 min。进样口温度:60 ℃；检测器的温度：280 ℃；载气∶氮气；分流比1∶30；离子源温度：200 ℃；扫描范围：45～600 AMU；进样量：1 μL。

图1 超临界CO2提取挥发油气相色谱图

根据以上条件分析经前方挥发油,得总离子流图(图1)。根据面积归一化法确定每种提取物在总提取物中所占的的质量百分数。结果我们检测出40个色谱峰并且得到了35个化合物。见表1。

表1 超临界提取的挥发油成分

2.3 小鼠的扭体实验 将小鼠随机分配，8只1组，分为模型组、吐温组、挥发油的高剂量组、挥发油的中剂量组和挥发油的低剂量组、阿司匹林组。应用苯甲酸雌二醇注射液提高小鼠子宫的敏感度来进行造模，每天给予0.1 mL。造模的同时给予挥发油。在第4天给小鼠灌胃挥发油后40 min，每只小鼠腹腔注射缩宫素IU。随后观察每只小鼠在30 min内的扭体次数，并且进行了如下的记录。见表2。

表2 对痛经模型小鼠扭体次数的影响

注：与吐温组比较，##P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01,△P<0.05。

经过观察，吐温作为挥发油的助溶剂，在正常组给予生理盐水的同时按照比例加入了吐温，并没有对小鼠扭体产生影响。由于在比较吐温组与模型组时存在明显的差异(P<0.01),即造模成功。并且挥发油的模型组与挥发油的高剂量组、挥发油的中剂量组和挥发油的低剂量组3个组之间存在显著性的差异(P<0.01)，从小鼠的扭体平均数来看，挥发油高剂量组对于由缩宫素所导致的小鼠扭体有较好的抑制效果。

2.4 镇痛实验 准备40只雌性小鼠，随机分成吐温组、挥发油低剂量组、挥发油高剂量组、挥发油中剂量组和阿司匹林组，造模与给药方法同2.3，在第4天最后1次给药后30、60、120 min用智能热板仪来测定小鼠的痛阈值数据，并记录。见表3。

表3 对热刺激小鼠疼痛的影响

注：与吐温对照组比较,##P<0.01,#P<0.05。

与吐温对照组比较，挥发油高剂量组能显著提高小鼠在给药30～120 min的痛阈值，挥发油中剂量组能提高小鼠在30～60 min内的痛阈值(P<0.01;P<0.05)，在120 min时并没有较好的疗效。挥发油低剂量在短时间内疗效较好，而在60、120 min内均无较好的疗效。

3 结论

从表中结果看出，经前方挥发油中，相对含量较高的为藁本内酯和反式茴香脑，除此之外α-蒎烯、β-蒎烯、L-葑酮、L-柠檬烯等含量较多的成分均来自当归、川芎和小茴香,这与文献报道相近[7-10]。由此可见，用超临界萃取技术在密闭体系和较低温度下对药物有效成分进行提取，对产品的损失率较低，有效成分不易流失。因此在后续研究中，我们可以采用合并提取的方法，这样比单味药单独提取挥发油要减少资源浪费，并且省时，更容易操作。

经过药效学实验，进一步验证了当归的主要挥发油成分对子宫平滑肌具有抑制作用，当子宫内加压时，能使子宫收缩由无节律变为有节律的收缩。同时放慢子宫平滑肌的收缩频率。川芎中的挥发油同时可缓解子宫平滑肌痉挛并且起到抗炎疗效[11]。

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