脾虚证模型大鼠血清中血管活性肠肽和胆囊收缩素的变化及四君子汤的干预作用

张海燕，陈君千，张 望，黄绍刚，黄穗平

(1.广东省中医院，广州 510120；2.广州中医药大学，广州 510405)

中医学认为脾胃是人的后天之本，是脏腑学说的中心，脾虚证的实验研究涉及脾与神经内分泌功能、微量元素吸收、免疫功能、消化吸收功能、酶学变化等诸方面[1]。本研究探讨脾虚证大模型鼠血清中神经内分泌激素血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)的变化以及四君子汤对血管活性肠肽和胆囊收缩素的影响，进一步阐明四君子汤调节胃肠动力的机制。

1 实验材料

SPF级健康成年雄性SD大鼠60只,体质量200～250 g，购自广州中医药大学实验动物中心，动物合格证：44007200000275。小承气汤：以《伤寒论》为依据，其组方为：大黄12 g，枳实6 g，厚朴9 g；四君子汤：以2000年版中国药典为依据,其组方为:党参20 g，白术(炒)20 g，茯苓20 g，甘草(蜜炙)10 g。药材均为颗粒剂，由江阴天江药业有限公司生产。加蒸馏水溶解后配制为含生药1 g/mL溶液。莫沙必利：江苏豪森药业股份有限公司生产(批号：130402)，规格：每片5 mg，将药片研为细粉，加蒸馏水溶解后配制成1 mg/mL的混悬液。Elisa试剂盒：USCN试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司生产，VIP产品编号:CEA380Ra，Lot：L130823515；CCK产品编号：CEA802Ra，Lot：L130822500)。水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司，批号：20130314。LX-100手掌型离心机(江苏海门市其林门尔仪器有限公司)；DG5033A型酶联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)；Ultra Pure UF型和泰凯弗隆实验室纯水系统(上海和泰仪器有限公司)；CU-420型电热恒温水浴箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

2 实验方法

SPF级健康成年雄性SD大鼠60只,采用架式笼养喂养，随机分为正常组、模型组、四君子汤组、莫沙必利组，每组15只。参照参考文献[2-3]，采用饥饱失常、劳倦、耗气破气法复制脾虚证大鼠模型，正常组不予造模。模型组、四君子汤组、莫沙必利组大鼠每日灌服小承气汤溶液(小承气汤每日灌胃量为0.5 g/200 g体质量，具体计算方法见“给药方法”)，隔日半量进食，每日下午将大鼠放入水深50 cm、水温20 ℃的水槽中游泳，以力竭为度(大鼠鼻尖没入水面10 s)，造模2周。

根据陈奇主编的《中药药理研究方法学》，按照动物体表面积比率换算等效剂量法计算大鼠给药量，公式为：大鼠用量(g/kg)=人原生药用量(g)×0.018×5。四君子汤组大鼠每日灌胃量为1.26 g/200 g体质量,莫沙必利组大鼠每日灌胃量为0.27 mg/200 g体质量，正常组和模型组大鼠每日灌服生理盐水量为1 mL/200 g体质量。连续用药15 d。

大鼠禁食不禁水24 h后，用7%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 mL/100 g体质量)后，迅速剖腹，腹主动脉取血2 mL，离心后置-80 ℃冰箱保存备用。

VIP、CCK酶联免疫分析：参照试剂盒说明书执行。

3 实验结果

3.1 各组大鼠一般情况及体质量变化 正常组大鼠在整个实验过程中一直精神良好，活动自如，反应灵活，毛色光润，摄食正常，大便呈颗粒状。造模后各组大鼠于第2天开始泄泻,大便水分明显增多，第7天泄泻明显,大便溏稀、色黑，肛门周围有污物，游泳耐力明显下降；第10天出现眯眼，成群蜷缩明显，扎堆，拱背，精神倦怠，嗜卧，进食减少，反应迟钝，拉尾排便次数增多，肛门秽浊；到第14天，大鼠明显消瘦，毛色晦暗无光泽，提示造模成功。观察造模后各组大鼠体质量明显下降，亦提示造模成功。

经药物治疗后，四君子汤组与莫沙必利组大鼠于第2天大便水分已减少，渐成形，第3天开始进食量恢复正常，第5天活动较前增加，反应较前灵敏，第7天精神良好，活动正常，反应灵活，毛色正常。模型组大鼠恢复较四君子汤组和莫沙必利组慢3～4 d。

表1 各组大鼠体质量变化比较

注：与正常组比较，#P<0.01；与模型组比较，△P<0.05。

3.2 各组大鼠血清血管活性肠肽和胆囊收缩素含量测定结果 模型组大鼠血清中血管活性肠肽含量明显减少，与正常组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；经治疗后，四君子汤组和莫沙必利组大鼠血清中血管活性肠肽含量较模型组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠血清胆囊收缩素含量明显升高，与正常组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；经治疗后，四君子汤组大鼠血清胆囊收缩素含量较模型组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)，莫沙必利组大鼠血清胆囊收缩素含量较模型组降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清血管活性肠肽和胆囊收缩素含量比较 pg/mL

注：与模型组比较，#P<0.05。

4 讨论

从最早的单因素造模法逐渐到复合法，再到病证结合的造模法无一不显示着脾虚动物模型复制方法的日趋成熟。本实验采用大黄、厚朴、枳实苦寒泻下之品，游泳力竭及限量饮食法复合因素，复制脾虚证大鼠模型，是在中医理论的指导下从本质上对证候进行复制，并充分体现了中医致病因素的多重性。参照大鼠脾气虚证模型评定标准[2]，结合本实验各组大鼠一般情况及体质量变化，提示成功建立脾虚证模型。

血管活性肠肽是肠神经系统中具有代表性、研究最深入的神经肽，是重要的肽类神经递质之一。血管活性肠肽神经元按功能不同分为运动神经元与分泌神经元，运动神经元使胃肠及其括约肌舒张，分泌神经元可刺激胰液和肠液分泌，保护肠黏膜，调节胃肠吸收[4]。血管活性肠肽的降低可使大鼠胃肠平滑肌收缩、运动增强，造成食物在胃肠内停留时间缩短，吸收障碍，电解质平衡出现紊乱，从而表现便溏、腹泻症状。本实验采用饥饱失常、劳倦、耗气破气复制脾虚证大鼠模型，模型组大鼠血清中血管活性肠肽含量较正常组明显降低。大鼠血清中血管活性肠肽含量减少可能是该模型出现便溏、腹泻等症状的原因之一。胆囊收缩素分泌细胞主要位于十二指肠近段和空肠黏膜，在体内的生理作用有抑制胃排空，抑制近端十二指肠蠕动，促进远端十二指肠和空肠蠕动，促进胆囊收缩等[5]。胆囊收缩素的升高，抑制胃排空和加速空肠蠕动的作用加强，与模型组大鼠出现纳差、腹泻的症状相符合。

四君子汤是健脾益气中药的代表方，是治疗脾虚证的经典方。实验结果显示，四君子汤颗粒剂可提高脾虚证大鼠血清中的血管活性肠肽含量，疗效与西药莫沙必利相当，同时可提高脾虚证大鼠血清中胆囊收缩素含量，且疗效优于西药莫沙必利。从而推测，对于胃肠动力的改善，血清中血管活性肠肽含量和胆囊收缩素含量起协同作用，使胃肠平滑肌的蠕动保持正常的张力和节律，改善大鼠纳差、腹泻症状，从而使体质量增加，活动恢复正常。

本研究结果显示，采用饥饱失常、劳倦、耗气破气造模法复制脾虚证大鼠模型在一定程度上出现了胃肠功能的紊乱症状，这些症状的出现可能与大鼠胃肠激素的改变有关，表明脾虚证存在着内分泌调节的异常，胃肠激素的改变对脾虚证的发生可能起着重要的直接或间接作用。脾虚证大鼠通过四君子汤治疗后，血管活性肠肽和胆囊收缩素都接近正常水平，提示四君子汤能调节脾虚证大鼠的胃肠激素，从而纠正其胃肠功能紊乱，这是该方治疗脾虚证的作用机制之一。

[1]聂建华,孙世发.中医脾虚证的近10年相关研究[J].中医药学报,2011,39(1):128-130.

[2]施旭光,翟理祥,邓淙友,等.脾气虚证4种造模方法的比较研究[J].广州中医药大学学报,2013,30(2):196-199.

[3]刘华生,陈铭佳,王艳明,等.4种脾虚证造模方法的差异性研究[J].中医药信息,2005,22(4)79-80.

[4]Nussdeofer G G,Malendowicz L K.Role of VIP,PACAP and related peptides in the regulation of the hypothalamo pituitary adrenal axis[J].Peptides,1998,19(8):1443-1467.

[5]朱金照,陈东风,冷恩仁.胃肠肽在胃肠运动调节中的作用[J].世界华人消化杂志,1997,7(8):687.