地黄饮子对快速老化小鼠SAMP8学习记忆能力及海马神经元结构的影响

袁晓霞,宋 琳,吴 颂,关慧波

(1.新疆医科大学，乌鲁木齐 830011；2.新疆名医名方与特色方剂学实验室，乌鲁木齐 830011；3.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；4.秦皇岛市中医医院,河北 秦皇岛 066000)

老年性痴呆，即阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，AD)，属进行性神经退行性疾病，涉及记忆力、理解力、判断力、方向感等方面,以Aβ沉积、神经纤维缠结、神经元丢失为主要病理特征[1-2]。地黄饮子是防治老年性痴呆的有效常用方剂。本课题选用与人衰老和痴呆均比较接近的快速老化小鼠P8(Senescence accelerated mouse prone 8,SAMP8)作为老年性痴呆模型，试从行为学及形态学方面研究地黄饮子水丸抗老年性痴呆的作用机制。

1 材料与仪器

7月龄SAMP8小鼠24只，同源同月龄的SAMR1小鼠8只，均为雄性,体质量(25±5) g，由天津中医药大学第一附属医院老年脑病研究室动物中心提供(合格证号：W-J津实动质M准字第006号)。在正式实验前适应性喂养2周，室温22～26 ℃，湿度55%左右，日常光照，饮水及饲料均经高温蒸汽灭菌。地黄饮子水丸：熟地黄、巴戟天、山茱萸、石斛、肉苁蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、麦冬、石菖蒲、远志、薄荷各15 g，生姜10 g，大枣5 g(所有药物购自哈尔滨松茂药材站)，按处方比例制丸；盐酸多奈哌齐片(安理申):10 mg/片，生产企业：法国PFIZER PGM公司，分包装批准文号：国药准字J20040020。ZIL-2小鼠跳台仪:中国医学科学院药物研究所；JEM-1220型透射电镜：日本电子公司；BX60光学显微镜：OLYMPUS日本产；病理图像分析系统：cimas Med6.0，麦克奥迪图像技术有限公司。

2 方法

3 结果

3.1 地黄饮子对SAMP8小鼠跳台行为学的影响 见表1。

表1 地黄饮子对SAMP8小鼠跳台行为学的影响

注：与模型组比较,#P<0.05，##P<0.01;与第1天比较,△P<0.05，△△P<0.01。

第1、2天各组的潜伏期数据经Levene’s方差齐性检验，P≤0.10，该数据为方差不齐。首先以多个独立样本比较的Kruskal-Wallis秩和检验,P<0.05，认为各组有差异。进一步采用LSD法做多重比较。结果表明空白组的潜伏期与模型组比较有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。给药后，地黄饮子组和安理申组潜伏期与模型组比较有统计学意义(P<0.01)。 相同组的第2天潜伏期与第1天比较采用两样本均数比较的t检验，结果表明第2天潜伏期与第1天比较除模型组以外，各组均非常显著延长(P<0.01)。

3.2 地黄饮子对SAMP8小鼠海马神经元形态结构的影响 HE染色光镜下可见：空白组SAMR1小鼠海马CA1及CA3区结构完整正常，神经元排列整齐致密，层次清楚，细胞核多呈圆形，大且规则，核仁清晰。模型组海马CA1及CA3区细胞排列紊乱、疏松，细胞数量明显减少，层次性较差，且细胞肿胀，多见核深染、固缩现象，神经元呈弥漫性颗粒空泡变性。地黄饮子组与安理申组海马CA1及CA3区的神经元病理表现较模型组有明显改善，神经元排列较疏松紊乱，细胞层数较空白组相对减少，细胞肿胀，核深染、固缩现象及神经元颗粒空泡变性等情况较模型组明显减少。安理申组与地黄饮子组比较，其CA3区神经元病理改善程度更明显，2组CA1区情况基本一致。

3.3 地黄饮子对SAMP8小鼠海马神经元超微结构的影响 电子显微镜下观察各组小鼠海马区神经元超微结构可见：空白组海马区神经元胞体密集排列，细胞核以常染色质为主，核仁明显，神经毡区未见纤维的缠绕。神经元细胞核呈圆形或椭圆形，核膜圆滑，核仁清晰。核膜双层结构清晰，胞浆内可见线粒体、粗面内质网游离核糖体、少量的溶酶体及神经微丝。高倍镜下可见神经元胞体内含有丰富的游离核蛋白体和尼氏小体。模型组海马神经元排列非常紊乱，而且神经元胞体固缩，核膜下可见高密度染色质边集，或块状散布核内，核膜模糊，出现神经元早期凋亡的变化，神经元胞体内尼氏体扩张、脱颗粒，线粒体空泡变性，细胞内可见大量脂褐素。神经毡区神经纤维缠绕，紊乱排列，神经纤维内线粒体嵴性肿胀。胶质细胞核固缩，胶质细胞数量明显增多。安理申组神经元形态基本正常，核膜圆滑，核仁清晰。核膜双层结构清晰。个别神经元线粒体肿胀，粗面内质网略有减少，溶酶体稍增多，脂褐素略有增多，核膜下有极轻微的染色质边集，核膜、核周隙间断性增宽，粗面内质网脱颗粒。部分神经纤维有肿胀，髓鞘轻度崩解。地黄饮子组神经元形态规则，核膜圆滑，核仁清晰。核膜双层结构清晰，线粒体形态正常，粗面内质网略有减少，溶酶体稍增多，脂褐素消失，核内有异染色质的块状散布。神经纤维紊乱缠绕。

4 讨论

老年性痴呆与中医“痴呆”“呆病”“健忘”“癫病”“郁证”等相类似[4]。脑性清灵，脑清则神明，主持有度，灵动机敏，思维敏捷，反应灵敏[5]。脑失清灵而发的老年性痴呆，以本虚标实为基本病机。本虚主要在于肾精不足，髓海亏虚，清阳不升，脑髓失养；标实在于痰浊、瘀血或痰浊瘀血互结蒙蔽清窍，闭阻脑络。本虚与标实两者之间又互为因果，肾虚可以导致痰浊、瘀血，痰浊、瘀血又可反过来加重肾虚，形成恶性循环，以致本病缠绵难愈。何慧等[6]对老年性痴呆的中医治则治法规律进行研究，也验证了老年性痴呆的病机关键在于肾；治疗以补肾为主，兼以活血化瘀，化痰开窍。中药治疗老年性痴呆备受关注[7]。中药方剂具有多靶点效应，作为一个整体进入人体，通过多成分、多途径、多层次的综合协调作用，可以调动机体的自稳态及自我修复能力，从而达到治疗作用[8]。

SAMP8小鼠主要的特点就是在渡过生长期(4～6月)后，伴快速老化自然发生的认知障碍，这与临床痴呆的渐进性发生是极为相似的。与其同源对照组R1相比，其行为学、形态学、神经生化、多种酶类以及蛋白质和基因表达等均出现异常[9]。因此有学者认为，SAMP8小鼠是目前较理想的老年性痴呆替代模型[10]。

小鼠跳台行为实验显示，第1、2天的模型组潜伏期与空白组比较缩短，提示SAMP8小鼠被动回避反应能力下降，学习记忆能力显著降低。给药后地黄饮子组和西药对照组均可使各组小鼠潜伏期延长，表明被动反应能力均有所提高，与模型组比较，有统计学意义，说明地黄饮子有类似安理申提高SAMP8小鼠学习记忆能力的作用，且2组之间比较无统计学意义。第2天潜伏期与第1天比较，除模型组以外，其他各组均非常显著延长，提示空白组和安理申组、地黄饮子组记忆能力增强。 经地黄饮子治疗的SAMP8小鼠海马CA1、CA3区神经元排列较疏松紊乱,细胞层数减少，细胞肿胀、核深染、固缩现象及神经元颗粒空泡变性较模型组明显减少。SAMP8小鼠经地黄饮子治疗能减轻海马神经元的损伤,提高其学习记忆能力。

[1]Reza M Salek,Jing Xia,Amy Innes.A metabolomic study of the CRND8 transgenic mouse model of Alzheimer’sdisease[J].Neurochemistry International,2010,56:937-947.

[2]王虎平,吴红彦.逍遥散及其配伍组方对阿尔茨海默病小鼠学习记忆的影响[J].中国老年学杂志,2013,33(8):4459.

[3]George Paxions,Charles Watson.大鼠脑立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版社,2005:7.

[4]尹龙,田金洲,时晶.阿尔茨海默病的中医病机探讨[J].吉林中医药,2011,31(6):495-497.

[5]么洪文.老年痴呆症的中医辨证与治疗[J].中国社区医师,2004,20(20):20.

[6]何慧,张玉莲,崔远武.老年性痴呆中医治则治法规律研究[J].吉林中医药,2012,32(2):125-127.

[7]张磊,杨苏蓓.老年痴呆症发病机制下的治疗药物研究[J].中国现代药物应用,2010,4(20):238.

[8]毛蕾,张玉莲.补肾填精中药治疗老年性痴呆[J].吉林中医药,2010,30(5):394-396.

[9]吴天,张翔,柳澄.Alzheimer病的临床、病理及影像学表现[J].医学影像学杂志,2006,16(1):95.

[10]周伟勤,毕明刚,杜冠华.快速老化小鼠SAMP8研究进展[J].中国药理学通报,2009,25(5):565-568.