高效液相色谱法测定三金颗粒中羟基积雪草苷含量

朱雪妍，林燕翔

（广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530021）

三金颗粒是由金樱根、金刚刺、羊开口等5味中药制备而成，具有清热解毒、利湿通淋、益肾的功效。目前三金颗粒的质量标准[1]均过于简单，没有含量测定项目。为确保临床疗效及有效控制产品质量，笔者以羟基积雪草苷[2－3]作为含量测定指标，建立了三金颗粒中积雪草[4]的含量测定方法。现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent高效液相色谱仪；Chemstation色谱工作站；MILLIPROA纯水处理器。羟基积雪草苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号为110893－200201，供含量测定用，经高效液相色谱法测定纯度为97．35%）；三金颗粒（市售品）；乙腈为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：ODS Hypersil C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），流动相：乙腈 －2 mmol／L β－环糊精溶液（24 ∶76）；流速：1．0 mL ／min；检测波长：205 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2．2 溶液制备

取羟基积雪草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0．2 mg的溶液，即得对照品溶液。取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取约10 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率 320 W，频率 40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，减压回收至干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并提取液，用氨试液洗涤2次，每次20 mL，取正丁醇液，减压回收至干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺积雪草阴性样品适量，按供试品溶液制备方法进行操作，制备得阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

干扰试验：分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按2．1项下色谱条件记录色谱图。结果见图1，表明阴性样品对测定无干扰。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密称取羟基积雪草苷对照品22．48 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。精密吸取以上对照品溶液 0．1，0．3，1．0，5．0，10．0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密量取以上溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行测定。以对照品进样量为横坐标（X）、峰面积积分值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程Y＝182．48X＋5．454 4，r＝0．999 9（n＝5）。结果表明，羟基积雪草苷进样量在 0．218 8 ～21．884 3 μg范围内峰面积积分值呈良好的线性关系。

精密度试验：取同一对照品溶液，按2．1项下色谱条件连续测定6次。结果羟基积雪草苷峰面积的RSD为0．35%（n＝6），表明仪器的精密度良好。

稳定性试验：取同一对照品溶液（批号为100701），每隔一定时间测定1次，共测定5次。结果羟基积雪草苷峰面积的RSD＝1．36%（n＝5），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品（批号为100701），依法制备供试品溶液，按2．1项下色谱条件平行测定6次。结果羟基积雪草苷平均含量为 0．097 31 mg／g，RSD＝2．41%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取羟基积雪草苷对照品20．46 mg（含量为97．35%），精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取 2．00，5．00，10．00 mL，分别置 200 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液A，B，C。取已知含量的样品（批号为100701，羟基积雪草苷含量为0．097 31 mg／g），研细，取约5 g，精密称定（共9份），置锥形瓶中，分为3组，分别精密加入对照品溶液A，B，C 50 mL，按供试品溶液制备方法制备待测溶液并依法测定含量，计算加样回收率。结果见表1。

表1 羟基积雪草苷加样回收试验结果（n＝9）

2．4 样品含量测定

取10批样品，按拟订的方法测定含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝2）

3 讨论

曾用ODS HYPERSIL C18柱，Symmetry及Kromasil C18柱等不同品牌色谱柱测定同一样品（批号为100701）含量，结果色谱图中羟基积雪草苷峰与相邻杂质峰分离良好，理论板数均在5 000以上，且3根不同品牌色谱柱测得的羟基积雪草苷含量的RSD为25%，说明系统适用性良好。

对于样品提取方法，分别用超声提取和加热回流提取进行比较，结果以超声提取较完全；对提取溶剂甲醇、80%甲醇、无水乙醇进行了考察，结果表明，采用甲醇提取较为完全；还对提取时间（20，30，60 min）进行了考察，结果以30 min和60 min提取的更完全，且相差不大；再对水饱和的正丁醇萃取次数（2，3，4次，每次20 mL）进行了考察，结果表明，萃取3次即可提取完全；最后比较了用氨试液洗涤次数（1，2，3次，每次20 mL），结果表明通过碱洗能大大减少杂质对色谱分析的影响，且洗涤2次即可除去较多的杂质。

[1]WS3－B－3746－98．中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第二十册）[S]．

[2]陈云艳，翁小香，周 靖，等．积雪草总苷及其制剂的含量研究．Ⅱ．积雪草总苷中积雪草苷，羟基积雪草苷和积雪草苷B含量的HPLC法测定[J]．中国医药工业杂志，2010，41（4）：276 －279．

[3]杨于琴，丁永辉，夏玉凤．积雪草活性成分的分析方法及药理作用研究进展[J]．中国野生植物资源，2010，29（3）：6 －9．

[4]齐红梅，王冬梅．积雪草化学成分及药理研究进展[J]．中国药业，2010，19（16）：89 － 90．