钙敏感受体在人骨关节炎软骨中的表达研究

刘 军 曹建刚 姚庆斌 李稚君1， 付 鑫 马信龙，4△

钙敏感受体在人骨关节炎软骨中的表达研究

刘 军1，2曹建刚1，2姚庆斌3李稚君1，3付 鑫2马信龙1，2，4△

目的 研究钙敏感受体(CaSR)在人骨性关节炎(OA)软骨中的表达强度，探讨其与OA发病机制的关系。方法收集5例因膝关节OA接受全膝关节置换术患者的股骨远端及胫骨近端标本，HE染色后根据Collins病理学分级标准进行关节软骨退变分级，Collins 0级切片8张为软骨正常组，CollinsⅡ级切片8张为软骨退变组，免疫组织化学染色后比较2组软骨组织内CaSR的表达强度。结果CaSR在OA软骨中阳性表达，CaSR在软骨正常组的表达强度低于退变软骨组（评分：1.63±0.95 vs 3.52±0.78，t=8.99，P＜0.05）。结论CaSR活化与关节软骨退变有关。

骨性关节炎；膝关节；软骨细胞；钙敏感受体；免疫组织化学

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种发病率很高的以软骨退行性变和继发骨质增生为主的慢性退行性骨关节疾病，多见于中老年人。临床以关节软骨损坏为主要病理特征，常影响患者的肢体功能和日常生活，严重时甚至造成关节残疾。患者关节软骨细胞外基质合成与降解失衡是造成软骨变性的重要原因之一。Yamaguchi等[1]发现在骨组织微环境中，软骨细胞和成骨细胞中钙敏感受体(CaSR)的活化能够促进骨重建过程，但其与OA软骨的关系尚未明确。本研究通过观察CaSR在膝关节OA软骨组织中的表达水平，探讨其在OA中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取在我院接受全膝关节置换的患者5例，其中女4例，男1例，年龄58～71岁，平均（65.40±5.32）岁；病史5.5～20.0年，平均（12.70±5.43）年。纳入标准：（1）符合中华医学会骨科学分会提出的骨关节炎诊治指南（2007版）中骨关节炎的诊断依据，并经膝关节置换术中证实。（2）无心血管、肝、肾等重要脏器病变。（3）术前4周未使用非甾体类抗炎药、皮质醇等。排除类风湿、感染性关节炎等其他关节疾患者。

1.2 主要试剂及耗材 CaSR抗体（Sigma公司），即用型高效免疫组化二抗试剂盒（优宁维生物公司），乙醇、二甲苯、PBS缓冲液、蒸馏水、防脱玻片、盖玻片、显微镜等由天津医科大学组织与胚胎学教研室提供。

1.3 实验方法 将全膝关节置换术中所取软骨及含软骨下骨标本用生理盐水冲洗后，肉眼初步筛选出软骨表面光滑的轻、中度退变组织块，切成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm小块，用体积分数为10％的福尔马林固定，自动脱水机脱水(全程14 h)，58～60℃石蜡包埋，5例膝关节标本共制作蜡块24枚，垂直于关节软骨切取5 μm厚组织切片。对组织切片进行HE染色后，根据Collins病理学分级标准将关节软骨退变分级如下[2]：0级为关节软骨正常，软骨细胞分布均匀。Ⅰ级为软骨浅表可见切线裂隙。Ⅱ级为纵行裂隙形成，软骨细胞增殖并呈簇状排列。Ⅲ级为深部裂隙形成，裂隙累及软骨全层深达钙化带，软骨剥脱，深部偶见少量软骨细胞增殖呈簇状排列。Ⅳ级为侵蚀软骨下组织，软骨完全剥脱，软骨下骨暴露，见明显骨赘。选取Collins 0级切片8张标记为软骨正常组，CollinsⅡ级切片8张标记为软骨退变组，分别对2组源蜡块再次切片后进行免疫组织化学染色，按二步法免疫组化染色试剂盒说明书进行操作，然后镜下观察。

1.4 免疫组化染色结果判定 采用半定量积分法对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞着色强度进行分级记分，然后根据两项之和确定其阳性强度[3]。阳性细胞率即阳性细胞占计数细胞的比例，每张切片计数5个400倍视野细胞：阳性细胞率10％为0分；10％～25％为1分；25.1％～50％为2分；50.1％～70％为3分；70.1％～100％为4分。阳性细胞着色强度：仅细胞核蓝色者为阴性，细胞浆棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性。阴性(-)为0分，弱阳性(+)为1分，阳性(++)为2分，强阳性(+++)为3分。

1.5 统计学方法 使用软件SPSS 19.0进行统计学分析处理，计量资料采用±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果 软骨正常组关节软骨基本正常，软骨细胞排列均匀，见图1；Ⅰ级切片5张，软骨表面见微小切线裂隙，少量簇聚的软骨细胞；Ⅱ级切片8张，可见软骨纵行裂隙形成，软骨细胞增生并呈簇状排列，见图2；Ⅲ级切片2张，软骨深部裂隙形成，裂隙达钙化带（潮线），偶见簇聚软骨细胞；Ⅳ级切片1张，可见软骨下组织侵蚀，软骨剥脱、缺失，软骨下骨暴露，软骨细胞少，排列凌乱，基质染色不均匀。

2.2 免疫组织化学结果 CaSR在膝OA软骨中阳性表达，阳性细胞染色位于软骨细胞胞浆中，分布密集呈棕黄色颗粒状，在OA退变期软骨细胞中的表达强度明显增高。CaSR在膝关节退变软骨(Collins病理分级Ⅱ级)中存在较高强度的表达，见图3；在正常膝关节软骨（Collins病理分级0级）中表达较少或无表达，见图4。CaSR在软骨正常组的表达强度低于软骨退变组（评分：1.63±0.95 vs 3.52±0.78，t=8.99，P＜0.05）。

3 讨论

OA是一种最为常见的非炎性滑膜关节疾病，目前对该病的病因和发病机制尚不完全清楚。研究发现，软骨细胞的凋亡过度是关节软骨退变发展成OA的重要原因[4]。CaSR是G蛋白偶联受体的C家族成员，由氨基胞外域、7个跨膜螺旋的跨膜域和胞内羧基尾部组成。CaSR主要分布在参与钙稳态调节的甲状旁腺、胃肠道、骨组织和肾组织以及其他细胞（如中枢和外周神经、肝脏，血细胞、胰腺β细胞等），其功能主要是维持Ca2+和其他金属离子稳态，还可调节细胞增殖、分化、离子通道开启、激素分泌等[5-6]。动物实验研究证实OA软骨组织中存在CaSR的表达，且软骨细胞和成骨细胞中CaSR的活化能促进骨重建过程[1，7]。为进一步证实人OA软骨与CaSR之间的关系，本研究通过免疫组织化学方法证实了人OA软骨中存在CaSR的表达，且其表达强度与软骨退变程度相关。CaSR在Collins病理分级为Ⅱ级软骨中的表达显著高于0级的软骨组织，但由于本研究排除了软骨细胞较少的Ⅲ级、Ⅳ级软骨组织切片，所以并不能证实OA中CaSR与软骨退变程度存在正相关。

国内外目前关于CaSR在骨关节炎中表达机制的研究较少，尤其是在人膝关节软骨细胞退变病理过程中CaSR的功能表达及其病理生理意义报道更少。尽管研究已证实，在成骨细胞中CaSR可促进细胞增殖、分化以及矿化作用；而在破骨细胞中，CaSR可引起细胞分化和凋亡[8-9]。但由于关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质构成，与骨代谢有所不同，软骨细胞通过分解代谢和合成代谢的细胞因子来调节保持微环境的平衡。根据软骨细胞的调节功能，可以把细胞因子分为分解代谢的细胞因子，包括：白细胞介素（IL）-1，肿瘤坏死因子（TNF）-α，IL-17，IL-18等；合成代谢的细胞因子，包括：胰岛素样生长因子（IGF）1，转化生长因子（TGF）-β，骨形态发生蛋白（BMP）2、4、6等[10]。因此以后研究CaSR在OA软骨组织中的作用可围绕与OA相关的细胞因子展开。

Fig.1 HE staining showed Collins grade 0,structural integrity of cartilage,evenly distributed chondrocytes(×100)图1 HE染色后Collins病理分级0级，软骨结构完整，软骨细胞均匀分布(×100)

Fig.2 HE staining showed Collins gradeⅡ,fissures formed in deep of cartilage,cartilage cells arranged in clusters(×100)图2 HE染色后Collins病理分级Ⅱ级，可见软骨深部裂隙形成，软骨细胞成簇排列(×100)

Fig.3 CaSR showed brown granular cytoplasm in the articular chondrocytes of knee OA of Collins gradeⅡ(×400)图3 CaSR在膝OA Collins病理分级Ⅱ级的关节软骨细胞胞浆中呈棕黄色颗粒状(×400)

Fig.4 CaSR weakly expressed in the articular chondrocytes of knee OA of Collins grade 0(×400)图4 CaSR在膝OA Collins病理分级0级的关节软骨细胞胞浆中仅见弱表达(×400)

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（2014-01-12收稿 2014-04-25修回）

（本文编辑 闫娟）

The Expression of Calcium-Sensing Receptor in Human Osteoarthritis Cartilage

LIU Jun1,2,CAO Jiangang1,2，YAO Qingbin3，LI Zhijun1,3，FU Xin2，MA Xinlong1,2,4△
1 General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China;2 Department of Joint Surgery,Tianjin Hospital; 3 Basic Medical College of Tianjin Medical University;4 Tianjin Institute of Integrative Medicine Orthopedics,Tianjin Hospital△

E-mail：maxinlong8686@sina.com

ObjectiveTo investigate calcium-sensing receptor(CaSR)expression level in osteoarthritis(OA)cartilage，and the relationship with OA pathogenesis thereof.MethodsThe degenerated human cartilage of distal femur and proximal tibia came from 5 patients with OA underwent total knee replacement surgery.The tissue specimens were stained by HE.According to the Collins histological grading standards,articular cartilage degeneration was classificated in specimens.Eight HE slices of Collins grade 0 were used as normal cartilage group.Eight HE slices of Collins gradeⅡwere used as degeneration cartilage group.The CaSR expression levels detected by immunohistochemical staining technique were compared between two groups.ResultsExpression of CaSR was detected in osteoarthritis cartilage.The expression intensity of CaSR was significantly lower in normal cartilage group than that of degeneration of cartilage group(score：1.63±0.95 vs 3.52± 0.78，t=8.99，P＜0.05).ConclusionThe activation of CaSR is associated with the degeneration of articular cartilage.

osteoarthritis；knee；chondrocyte；calcium-sensing receptor；immunohistochemistry

R684.3

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.018

天津市卫生局科技基金重点项目（2013kz063）

1天津医科大学总医院骨科（邮编300052）；天津市天津医院关节外科；3天津医科大学基础医学院；4天津医院、天津市中西医结合骨科研究所

△通讯作者 E-mail：maxinlong8686@sina.com