γH2AX对肺癌放射敏感性的预测效果

韩宝林 王 轩李立芳王永志王广舜

γH2AX对肺癌放射敏感性的预测效果

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目的 探讨人肺癌细胞受照后γH2AX表达量变化与肺癌细胞放射敏感性之间的关系。方法选择肺腺癌A549和小细胞肺癌SBC-3细胞株，采用细胞克隆形成实验检测经不同剂量（0、2、4、6、8、10 Gy）照射后A549 和SBC-3细胞的克隆形成率，并绘制细胞生存曲线；应用Western blot检测经2 Gy放射剂量照射后不同时间点（0 min、30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h）的细胞中γH2AX蛋白表达量。分析γH2AX蛋白表达量变化与肿瘤细胞放射敏感性的相关性。结果小细胞肺癌SBC-3细胞的放射敏感性明显高于肺腺癌A549细胞。两种细胞受照后1 h和6 h，γH2AX的表达量均与肿瘤细胞的平均致死剂量（D0）相关。结论γH2AX可以作为肺癌细胞放射敏感性的一个预测指标。

辐射耐受性；γH2AX蛋白；肺癌；放射敏感性

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下，已成为我国城镇居民恶性肿瘤的第一位死因[1]。放射治疗是不能接受手术治疗肺癌患者的主要治疗手段，但疗效较差，5年生存率仅5％～15％[2]。因为肿瘤的异质性致使肺癌患者的肿瘤放射敏感性差异较大，而临床上制定放疗方案却能考虑到这种个体化的差异，实现肿瘤个体化治疗的关键是对肿瘤放射敏感性进行预测。研究发现磷酸化的H2AX（γH2AX）可作为检测DNA双链断裂的一个强有力的新标志物[3]。本研究通过检测人肺癌细胞系A549和SBC-3接受放疗后的γH2AX表达水平，研究γH2AX表达与肺癌放射敏感性的关系，探讨其作为预测肺癌放射敏感性指标的可行性，以便指导肺癌临床个体化放疗。

1 材料与方法

1.1 材料 肺腺癌A549和小细胞肺癌SBC-3细胞株、PRMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Dhanks、25 cm2培养瓶、75 cm2培养瓶、PBS、哺乳动物蛋白提取剂、蛋白酶抑制剂、细胞刮刀、离心机、5×上样缓冲液、AP、TEMED、去离子水、1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8、1 mol/L Tris-HCl pH6.8、10％ SDS、30％丙烯酰胺、预染蛋白marker、PVDF膜、一抗、二抗、ECL发光液、化学发光凝胶成像仪、吉姆萨染液。

1.2 细胞克隆形成实验 将肺腺癌A549和小细胞肺癌SBC-3细胞分别培养于25 cm2培养瓶中，取指数生长期A549和SBC-3细胞，消化、悬浮、计数后，分别接种于10 cm培养皿中，每种细胞株按照不同照射剂量分为0、2、4、6、8、10 Gy，每个剂量设3个平行处理孔，接种后培养24 h待细胞贴壁后，分别给予相应剂量照射（Varian直线加速器，剂量率300 cGy/min）。照射时细胞置于培养瓶或者培养皿中，给予单次X射线照射，培养2周后，弃去培养液，PBS冲洗3遍并吸尽，多聚甲醛固定20 min，吉姆萨过夜染色后清水冲洗，荧光显微镜下观察克隆集落形态，拍照，计数50个以上细胞的的克隆数。根据公式：克隆形成率（PE）=（对照组克隆数/细胞接种数）×100％。计算存活分数（SF）=克隆数/（细胞数× PE）。采用单击多靶数学模型[S=1-（1-eD/D0）n]拟合细胞生存曲线。

1.3 Western blot实验 将肺腺癌A549和小细胞肺癌SBC-3细胞分别培养于25 cm2培养瓶中，待细胞贴壁并长满整个培养瓶约75％体积时，给予2 Gy射线照射，照射后放回细胞培养箱，并在照射后不同时间点（0 min、30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h）将相对应的培养瓶从细胞培养箱中取出，弃去培养液，PBS洗3遍并吸尽，细胞裂解液与蛋白酶抑制剂的混合液提取细胞总蛋白。BCA方法测定蛋白浓度，然后蛋白变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、封闭、兔抗人γH2AX作为一抗以及兔抗人β-actin为内参封闭过夜。再加入羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，最后进行化学发光反应。实验重复3次。采用Image J软件分析Western blot条带的灰度值。

1.4 统计学方法 采用SigmaPlot拟合放射生存曲线，采用SPSS15.0分析，多组比较采用F检验，2组比较采用t检验，线性相关分析γH2AX表达量与肿瘤细胞放射敏感性的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌A549细胞和小细胞肺癌SBC-3细胞的放射敏感性 SBC-3细胞的放射敏感性明显高于A549细胞（F=1 023.221，P=0.033），见图1。从拟合的细胞生存曲线得出放射敏感性参数SF和平均致死剂量（D0），SBC-3细胞的SF（0.376 vs 0.495）、D0(1.452 vs 2.490)均低于A549细胞。

Fig.1 The cell survival curves of two cell lines图1 两种肺癌细胞的生存曲线

2.2 两种肺癌细胞接受2 Gy照射后γH2AX的表达变化 SBC-3细胞和A549细胞经2 Gy射线照射后，γH2AX蛋白表达量在照射后1 h有明显升高，在照射后6 h明显降低，低于1 h（t分别为131.22和97.23，均P＜0.01），见图2、3。

Fig.2 The expression of γH2AX in A549 with 2 Gy radiation dose detected by Western blot assay图2 A549细胞株接受2 Gy照射后γH2AX蛋白随时间变化情况

Fig.3 The expression of γH2AX in SCB-3 with 2 Gy radiation dose detected by Western blot assay图3 SBC-3细胞株接受2 Gy照射后γH2AX蛋白随时间变化情况

2.3 γH2AX的表达量变化与肿瘤放射敏感性的相关性 两种细胞受照后1 h和6 h，γH2AX的表达量均与肿瘤细胞的放射敏感性参数D0相关，见表1。

Tab.1 The relation between radiosensitivity parameter D0and γH2AX expression in two lung cancer cell lines表1 γH2AX的表达量与肺癌细胞D0的相关性（r）

3 讨论

克隆形成实验可用来研究肿瘤细胞的增殖能力及细胞对不同杀伤因素的敏感性[4]。在评价照射导致细胞死亡方面，克隆形成实验常被作为“金标准”[5]。本实验的克隆形成实验结果表明，肺癌细胞系（A549和SBC-3）接受X线照射后，其细胞存活率均下降，且随着放射剂量增加，细胞存活率逐渐下降；放射敏感性指标显示，SBC-3细胞对放射线较敏感，表现为该组细胞生存曲线较陡，SF呈最低值0.376，代表平均致死量的D0值较低为1.452 Gy；相反，A549细胞对放射线不敏感，表现为该组细胞生存曲线较平缓，SF呈较高值0.495，代表平均致死量的D0值较低为2.490 Gy。

H2AX是组蛋白H2A家族成员之一。在H2AX的C端有一段由22个残基组成的高度保守的同源序列，其中包括1个139位的丝氨酸残基的丝氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸（Ser-Gln-Glu,SQE）结构域[6]。细胞在受到照射后，H2AX的SQE结构域中的丝氨酸残基迅速磷酸化并在DSBs位点簇集形成焦点。低剂量照射时，磷酸化H2AX所形成的焦点数量与照射造成的DNA双链断裂数量存在线性相关关系[7]，因此，γH2AX功能之一就是可以作为电离辐射后细胞发生DNA双链断裂损伤的指示器。DNA损伤时γH2AX能够快速募集一系列DNA损伤修复相关蛋白和信号因子，如BRCA1、Nbs1、53BP1、MRN复合物，从而间接修复DNA损伤[8]。Celeste等[8]研究发现在H2AX缺陷的细胞发生DNA双链断裂损伤时，其损伤修复相关蛋白也能向损伤位点处聚集，但是移动速度减慢并且不能持续聚集在损伤位点。一旦γH2AX介导的DNA损伤修复完成后，γH2AX会被蛋白磷酸化酶3等脱磷酸化[9]，形成H2AX，在其他DNA损伤修复中被重新利用，从而使γH2AX在损伤位点被有效地去除。即在电离辐射后，γH2AX存在一个形成与消失的过程，并且此过程体现着DNA损伤及其修复过程。本实验Western blot实验结果表明，各实验组γH2AX水平在照射后一段时间随着时间增加而增加，在1～2 h达到峰值，在随后的时间内，各组γH2AX水平随着时间的推移逐渐降低。γH2AX在受照后1 h、6 h的表达率与两种肺癌细胞的放射敏感性存在明显的相关性，且6 h的相关性更好。说明在接受照射后，A549细胞株的DNA损伤发生率明显低于SBC-3细胞株。而在受照后6 h，受损的DNA的修复率却明显高于SBC-3细胞株，这致使A549细胞株在受照后因照射所致的细胞死亡明显少于SBC-3细胞株，因此，SBC-3细胞株的放射敏感性明显高于A549细胞株。这些结果与生存曲线反应的结果相一致。所以，细胞在受照后不同时间点的γH2AX表达量的变化可以替代生存曲线来反映细胞的放射敏感性。近年来，已经有研究报道γH2AX可以作为肿瘤细胞DNA损伤的一个灵敏和特异的生物指标，可用于判断肿瘤对于放疗是敏感还是抵抗[9]。

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（2014-01-20收稿 2014-04-10修回）

（本文编辑 闫娟）

Assessing Radiosensitivity of Lung Cancer with the Expression of γH2AX

HAN Baolin1,WANG Xuan2,LI Lifang1,WANG Yongzhi1,WANG Guangshun3△
1 Department of Radiation Oncology,Clinical Hospital of Baodi of Tianjin Medical University,Tianjin 301800,China；2 Department of Intensive Care Unit,3 Department of Oncology△

E-mail:wgs@bdhospital.com

ObjectiveTo observe the relationship between expression changes of γH2AX and the radiosensitivity of lung cancer cells in vitro.MethodsThe radiosensitivity of lung cancer cell lines A549 and SBC-3 was measured by clone forming assay.The DSBs damage of lung cancer cell lines A549 and SBC-3 was determined by Western blot assay.ResultsThe clone forming rates of lung cancer cell lines A549 and SBC-3 were gradually decreased with the increased radiation dose.γH2AX expression was related to the cell radiosensitivity 1 hour and 6 hours after radiated.ConclusionThe phosphorylated histone γH2AX is a powerful tool to monitor DNA DSBs and to predict the radiosensitivity in lung cancer radiotherapy.

radiation tolerance；γH2AX protein；lung cancer；radiosensitivity

R734.2；R815.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.005

天津市卫生局科技基金资助项目（2012KZ003）

1天津医科大学宝坻临床学院放疗科（邮编301800），2 ICU，3肿瘤科

△通讯作者 E-mail:wgs@bdhospital.com