第三代端粒酶缺失小鼠皮肤表皮干细胞分离培养特性观察

张俊伶 黄 颂 路 璐 李德冠 吴红英 孟爱民

实验研究

第三代端粒酶缺失小鼠皮肤表皮干细胞分离培养特性观察

张俊伶 黄 颂 路 璐 李德冠 吴红英 孟爱民△

目的 观察第三代端粒酶缺失（G3Terc-/-）小鼠与野生型（WT）小鼠皮肤表皮干细胞数目及功能差异。方法利用流式细胞术对皮肤表皮干细胞进行数目分析及分选；实时定量PCR方法检测p21基因表达；表皮干细胞克隆形成数目检测细胞自我更新能力。结果WT小鼠基底部表皮干细胞与基底部上层表皮干细胞比例分别为（9.56±1.06）％和（1.22±0.08）％，在G3Terc-/-小鼠中这两部分细胞比例分别为（17.36±3.56）％和（2.92±0.72）％；G3Terc-/-小鼠p21相对表达水平为WT小鼠的6.4倍；WT小鼠每104个表皮干细胞能够形成（280.20±29.81）个克隆，G3Terc-/-小鼠每104表皮干细胞仅能够形成（29.28±5.24）个克隆，以上结果差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论与WT小鼠比较，G3Terc-/-小鼠皮肤表皮干细胞出现衰老性的损伤。

小鼠,基因敲除；皮肤衰老；干细胞；端粒,末端转移酶

当今社会老龄化现象日益严重，有关衰老及衰老相关疾病的分子机制的研究日益受到关注。衰老的标志为器官萎缩、干细胞功能衰退、功能干细胞池耗竭等[1]。皮肤表皮干细胞能够按照毛发生长循环周期生成新的毛发，也能在皮肤出现创伤时向上迁移，修复受损伤的表皮和皮脂腺，具有多种功能[2]。衰老的皮肤表现为胶原含量减少、弹性降低、干燥及褶皱增多、创伤修复能力减弱等，并可引起机体防御能力减弱及肿瘤易感性增加[3]。因此，研究皮肤表皮干细胞在衰老过程中的变化十分重要。端粒酶缺失小鼠模型是广泛应用的端粒缩短引起衰老的小鼠模型。第三代端粒酶缺失（G3Terc-/-）及以上的端粒酶缺失小鼠表现出明显的衰老相关特点[4]。p21基因表达增加是G3Terc-/-小鼠成体细胞衰老的特异性标志[5]。笔者利用端粒酶缺失小鼠模型观察衰老状态下皮肤表皮干细胞变化，旨在研究皮肤表皮干细胞衰老及人类衰老过程中皮肤表皮干细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级G3Terc-/-小鼠及同窝对照的野生型（WT）小鼠各5只，40周龄，雄性，WT小鼠平均体质量（30±1）g，G3Terc-/-小鼠平均体质量（20±1）g，饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心。

1.2 试剂与仪器 无EDTA胰酶购自Gibco公司；CD49f-PE 和CD34-FITC抗体购自eBioscience公司；RNA提取试剂盒及cNDA反转录试剂盒购自Takara公司；p21荧光标记探针和GAPDH荧光标记探针购自ABI公司；表皮干细胞克隆形成培养基购自Cellntec公司；荧光定量PCR仪，ABI公司，型号7500；流式细胞仪，BD公司，型号AriaⅡ。

1.3 实验方法

1.3.1 皮肤表皮细胞分离 脱臼处死小鼠，将小鼠躯干皮肤用手术剪分离剪断，参照文献[6]中的方法分离获取皮肤表皮细胞。

1.3.2 皮肤表皮干细胞抗体染色及流式细胞仪分选 将1.3.1中获取到的1 mL皮肤表皮细胞悬液计数，计算每个样本（WT与G3Terc-/-各5个样本）5×106个细胞加入至1.5 mL离心管内，再次以1 500 r/min离心5 min，去上清液。加入50 μL含0.5％BSA的PBS缓冲盐溶液，然后分别加入CD49f-PE抗体4 μL和CD34-FITC抗体5 μL，冰上避光孵育1 h。孵育抗体结束后用5 mL含0.5％BSA的PBS缓冲盐溶液洗2次，加入300 μL PBS进行流式细胞仪分选皮肤表皮干细胞。

1.3.3 实时定量PCR检测p21基因表达 流式细胞仪分选出5 000个基底部表皮干细胞，使用RNA提取试剂盒及cNDA反转录试剂盒进行RNA提取及cDNA合成。紫外分光光度计检测合成后的cDNA浓度并将样本调成相同浓度。取9 μL cDNA样本，以GAPDH作为内参，p21检测组加入10 μL实时定量PCR混合试剂，1 μL p21荧光标记探针；GAPDH检测组加入10 μL实时定量PCR混合试剂，1 μL GAPDH荧光标记探针。按照ABI7500实时定量PCR仪标准程序进行基因表达检测。检测结果以2-ΔΔCt方法进行计算以观察p21基因表达差异。

1.3.4 WT与G3Terc-/-小鼠皮肤表皮细胞克隆培养 胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞接种于6孔板内培养2 d，按照1.3.1中的方法获取新生鼠皮肤表皮细胞，以每孔2 000个表皮细胞接种至已有滋养层细胞的6孔板内，加入2 mL表皮干细胞克隆形成培养基，隔天换液，培养7 d后计数克隆形成数目[7]。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示。2组间均数比较采用独立样本均数t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组小鼠皮肤表皮干细胞数目比较 与WT小鼠比较，G3Terc-/-小鼠皮肤基底部表皮干细胞（CD49f-PE阳性同时CD34-FITC阳性细胞群）及基底部上层表皮干细胞（CD49f-PE阳性同时CD34-FITC阴性细胞群）比例明显增多，见图1、表1。

Fig.1 Representative image of epidermal stem cell flow cytometry图1 表皮干细胞流式细胞仪分析示意图

Tab.1 Comparing ratios of epidermal stem cell between two groups of mice表1 2组小鼠皮肤表皮干细胞比例比较（n=5，％，±s）

Tab.1 Comparing ratios of epidermal stem cell between two groups of mice表1 2组小鼠皮肤表皮干细胞比例比较（n=5，％，±s）

＊＊P＜0.01

组别WT小鼠G3Terc-/-小鼠t基底部表皮干细胞比例9.56±1.06 17.36±3.56 4.690＊＊基底部上层表皮干细胞比例1.22±0.08 2.92±0.72 5.277＊＊

2.2 2组小鼠皮肤表皮干细胞p21基因表达水平比较 与WT小鼠比较，G3Terc-/-小鼠基底部表皮干细胞p21相对基因表达水平明显增高，为WT小鼠的6.4倍，见图2。

Fig.2 Relative expression of p21 level of epidermal stem cell in two groups of mice图2 2组小鼠皮肤表皮干细胞p21表达水平比较

2.3 2组小鼠表皮干细胞形成克隆能力比较 与WT小鼠比较，G3Terc-/-新生鼠皮肤表皮干细胞克隆形成数目明显减少（[29.28±5.24）个/104vs（280.20± 29.81）个/104，t=18.533，P＜0.01]，克隆形成能力明显下降，见图3。

Fig.3 Microscope image of colonies obtained from isolated keratinocytes from two groups of mice(×4)图3 2组小鼠皮肤表皮干细胞形成克隆显微镜下观察图（×4）

3 讨论

3.1 皮肤表皮干细胞与毛发生长周期 毛发生长周期可分为生长期、退行期和休眠期。不同类型的表皮干细胞在毛发生长周期发挥着不同的作用。表皮干细胞可以通过对CD34和CD49f两种抗原的检测而分离开来，CD34和CD49f两种抗原均高表达的基底部表皮干细胞是出现在休眠期的细胞，CD34高表达而CD49f低表达的基底部上层表皮干细胞是出现在生长期的细胞[2]。

3.2 衰老状态下皮肤表皮干细胞数目及功能变化 本研究显示，与WT小鼠比较，G3Terc-/-小鼠基底部表皮干细胞和基底部上层表皮干细胞比例均明显增加，p21基因相对表达水平提高，表皮细胞形成克隆数目显著降低，每个克隆的体积显著减小，说明在衰老状态下，皮肤表皮干细胞数目应激性增加以应对在衰老时出现的各种外部因素刺激。之前有研究提示，在外部因素刺激下，与WT小鼠相比G3Terc-/-小鼠表皮干细胞表现出动员能力严重减弱和对增殖应答反应迟钝[8]，提示增加的细胞数目并不能缓解衰老引起的表皮干细胞功能受损[9]。与以往研究一致的是，与年轻小鼠（2月龄的C57/BL6小鼠）相比，自然衰老小鼠（18月龄的C57/BL6小鼠）同样出现皮肤表皮干细胞数目增多及功能下降[10]，说明衰老确实引起皮肤表皮干细胞损伤。

3.3 本研究的意义 本研究通过对衰老模型小鼠皮肤表皮干细胞的研究，建立了表皮干细胞分离培养方法，揭示了衰老小鼠表皮干细胞数目和功能变化以及衰老激活的相关信号通路变化，为衰老与表皮干细胞关系的研究奠定了基础，也为抗衰老相关药物研发提供模型依据。

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（2013-12-30收稿 2014-03-03修回）

（本文编辑 李鹏）

Isolation and Culture of Epidermal Stem Cells from the Third Generation of Mice That Were Knocked-out of Terc

ZHANG Junling,HUANG Song,LU Lu,LI Deguan,WU Hongying,MENG Aimin
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences,the Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Tianjin 300192,China MENG Aimin,E-mail：ai_min_meng@126.com

ObjectiveTo observe the difference in number of epidermal stem cell and its function between wildtype(WT)mice and the third generation of Terc knockout(G3Terc-/-)mice.MethodsFlowcytometry was used to analyse and sort epidermal stem cells;Quantitative real-time PCR is used to analyse the relative expression level of p21 in epidermal stem cells;Self-renewal ability was reflected by the number of colonies formed by epidermal stem cells.ResultsBasal and suprabasal ratios in epidermal stem cells in WT mice were(9.56±1.06)％and(1.22±0.08)％respectively;basal and suprabasal ratios in epidermal stem cell in G3Terc-/-mice were(17.36±3.56)％and(2.92±0.72)％respectively.Relative p21 expression level in G3Terc-/-mice was 6.40 fold to WT mice;Number of colonies formed by WT mice epidermal stem cells were(280.20±29.81)per 104cell,number of colonies formed by G3Terc-/-mice epidermal stem cells were(29.28±5.24)per 104cell,which present significant difference to each other（P＜0.05）.ConclusionCompared to WT mice,epidermal stem cells in G3Terc-/-mice were aging.

mice,knockout；skin aging；stem cells；telomerase

Q255

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.008

国家973重大专项资助项目（2011CB964800-G）；国家自然科学基金海外合作基金（81129020）；国家自然基金面上项目（81072237,81372928）；天津市重点基金资助项目（11JCZDJC19100）；教育部高等学校博士学科点专项基金（20111106110038）

中国医学科学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室（邮编300192)

△通讯作者 E-mail：ai_min_meng@126.com