一测多评法测定新疆两种洋甘菊中5种化学成分含量*

李建光,韩松林,2,赵东升,张海波,耿晶,李新霞

(1.新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830054;2.阿克苏职业技术学院,阿克苏 843000;3.新疆比尔兄弟生物技术有限公司,乌鲁木齐 830011)

一测多评法测定新疆两种洋甘菊中5种化学成分含量*

李建光1,韩松林1,2,赵东升3,张海波1,耿晶1,李新霞1

(1.新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830054;2.阿克苏职业技术学院,阿克苏 843000;3.新疆比尔兄弟生物技术有限公司,乌鲁木齐 830011)

目的 建立新疆两种洋甘菊中木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的一测多评含量测定方法。方法采用超高效液相色谱法,以芹菜素为内标物,建立其与木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的相对校正因子,并进行含量测定,实现一测多评。同时采用外标法测定11批洋甘菊中木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的含量,验证一测多评法的准确性。结果外标测定法5种化学成分在标准曲线范围内均呈良好线性关系(r>0.999 3);平均加样回收率分别为:木犀草苷99.7%、芹苷元-7-葡萄糖苷97. 5%、7-甲氧基香豆素98.8%、木犀草素100.9%、芹菜素99.1%,RSD分别为1.8%,0.6%,0.5%,1.8%,1.9%。一测多评法中芹苷元-7-葡萄糖苷、木犀草苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素相对芹菜素对照品的校正因子f分别为1.441,2.308,1. 117,1.490,RSD分别为0.07%,0.04%,0.09%,0.18%。采用一测多评法计算的含量值与外标法实测值之间无显著差异。结论在对照品缺乏、昂贵的情况下,以外标法测定芹菜素,利用相对校正因子实现对木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的含量测定可行。

母菊;罗马洋甘菊;色谱法,超高效液相;一测多评法

新疆有两种常用洋甘菊,一种是德国洋甘菊,为一年生草本植物,即母菊,学名:Matricaria chamomillaL.,植物名:Matricaria recμtita[1];一种是罗马洋甘菊,一至多年生草本,学名:Anthemis nobileL.,植物名: Chamaemelum nobile。两种洋甘菊都具有药用价值[2-6]。洋甘菊有很悠久的使用历史,《德国药典》[7]、《美国药典》[8]收载为母菊,《欧盟药典》[9]收载为罗马洋甘菊。我国《国家药品标准维吾尔药分册》收载为母菊,但只有显微鉴别,没有薄层鉴别和含量测定,现已列为国家药品标准提高品种,本课题组拟建立母菊的药材质量标准。

一测多评法(quantitativeanalysisofmulticomponents by single marker,QAMS)是一种用于多成分质量控制的研究思路,用于解决中药质量控制中缺乏对照品这一瓶颈问题[10],并成功应用于中药中同类型成分和不同类型成分的含量测定[11-15]。该方法已被《中华人民共和国药典》2010年版一部收录[16]。

笔者在本研究中首先建立两种洋甘菊的超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)测定条件,然后以芹菜素对照品为内标建立两种洋甘菊中5种化学成分含量测定的一测多评法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 超高效液相色谱仪,Waters Acquity UPLC System,BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm) Empower色谱工作站;水浴锅(PAIRSTIRRER PS-1000,50 Hz,0.75 kV,TOKYO RIKAKIKAI CO.,LTD); pH计(satRorius PB-10);离心机(MULTIFUGE X3R);分析天平(AB135-S)。

1.2 试药 芹苷元-7-葡糖糖苷(成都普瑞科技有限公司,纯度:99%,批号:A110222),芹菜素(成都普瑞科技有限公司,纯度:99%,批号:A110605),7-甲氧基香豆素(美国西格玛奥德里奇公司,SAFC,纯度:98%,批号:11409PC),木犀草苷(中国食品药品检定研究院,纯度:99.3%,批号:111720-200905),木犀草素(成都普瑞科技有限公司,纯度:99%,批号:L120321);乙腈[Fisher Scientific,赛默飞世尔科技(中国)有限公司,纯度:99.9%,批号:20120112],甲醇[Fisher Scientific,赛默飞世尔科技(中国)有限公司,纯度: 99.9%,批号:20120217],甲醇(天津市富宇精细化工有限公司,分析纯,批号:070911),N-N二甲基甲酰胺(天津市富宇精细化工有限公司,分析纯,批号: 110713);磷酸二氢钾(天津市光复精细化工研究所,纯度:99.5%,批号:20100517),氢氧化钠(天津市致远化学试剂有限公司,纯度:96%,批号:20111120),盐酸(北京化工厂,分析纯,批号:20111020),磷酸(天津永晟精细化工有限公司,纯度:85%,批号:20120202)。母菊、罗马洋甘菊均采自新疆各地区或购买于新疆各市场。乌鲁木齐市场购样1(批号:20120613),2(批号:20120605),3(批号:20120608),4(批号: 20120625)于2012年6月分别采于新疆昌吉呼图壁县、玛纳斯县、吉木萨尔县、奇台县。昌吉市场购样(批号:20120706)于2012年7月采于昌吉市区。阜康样、策勒样均采于2012年5月。阜康样(批号: 20120514)采于新疆昌吉阜康市;策勒第一批样(批号:20120508)、策勒第2批样(批号:20120514)采于和田策勒县。维吾尔医院样、和田样、伊犁样采收时间均为2012年7月。维吾尔医院样(批号:20120703)来源于昌吉木垒县,和田样(批号:20120710)采于和田市区,伊犁样(批号:20120716)采于伊犁伊宁县。所有样品均保存于新疆医科大学药学院分析测试中心。按照《美国药典》对性状的描述,经新疆医科大学药学院胡君萍教授对11个批次样品鉴定确认。其中阜康样、策勒样为母菊;乌鲁木齐市场购样、昌吉市场购样、维吾尔医院样、和田样、伊犁样为罗马洋甘菊。

2 方法与结果

2.1 方法学考察

2.1.1 色谱条件 稀磷酸:取磷酸5.0 mL置于含水50 mL的100 mL量瓶中,加水至刻度,混匀。流动相A:制备浓度为0.005 mol·L-1的磷酸二氢钾溶液,用稀磷酸调节pH为2.55±0.05。流动相B:制备乙腈和甲醇的混合物(65∶35)。

色谱柱BEHC18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流速: 0.3 mL·min-1;检测波长:335 nm;温度为37℃;进样量1.5 μL;按照表1程序进行洗脱。典型色谱图见图1。

表1 洗脱程序Tab.1 Elution program

2.1.2 对照品溶液的制备 取芹苷元-7-葡萄糖苷、芹菜素、木犀草苷,精密称定后分别溶于适量N-N二甲基甲酰胺后以甲醇稀释,使浓度分别为1.317, 1.246,1.085 mg·mL-1,取7-甲氧基香豆素、木犀草素精密称定后分别溶于甲醇,使浓度分别为1.042和1.059 mg·mL-1。

2.1.3 供试品溶液的制备 取母菊1.0 g,精密称定后置一装有回流冷凝器和搅拌器的烧瓶中,加甲醇80 mL,搅拌下加热回流1 h。冷至室温,滤过,收集滤液于100 mL量瓶。用甲醇3 mL冲洗烧瓶,冲洗液过滤后并入量瓶中,加甲醇至刻度,混匀并过滤。取上述溶液25.0 mL置一装有回流冷凝器和搅拌器的圆底烧瓶中,加氢氧化钠溶液5.0 mL(将氢氧化钠0.4 g溶于水5.0 mL制成),加热回流25 min。冷却,用36%～38%盐酸调节该溶液pH至5.0～6.2。定量转移此溶液于50 mL量瓶,用甲醇稀释至刻度,混匀并过滤,弃去初滤液10 mL,取续滤液作为供试品溶液。同法制备罗马洋甘菊供试品溶液。

1.木犀草苷;2.芹苷元-7-葡萄糖苷;3.7-甲氧基香豆素;4.木犀草素;5.芹菜素图1 母菊(A)、罗马洋甘菊(B)、混标(C)UPLC典型色谱图1.galuteolin;2.apigenin-7-glucoside;3.7-methoxycoumarin; 4.luteolin;5.apigeninFig.1 Typical UPLC chromatograms of Chamomile, Roman Chamomile,and mixed reference substance

2.1.4 线性范围、检出限和定量限 分别精密吸取不同体积“2.1.2”项下(1.085 mg·mL-1木犀草苷、1.317 mg·mL-1芹苷元-7-葡萄糖苷、1.042 mg·mL-17-甲氧基香豆素、1.059 mg·mL-1木犀草素、1.246 mg·mL-1芹菜素)对照品贮备溶液,制成含木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素不同质量浓度的系列混合溶液。按上述色谱条件测定,以对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)计算标准曲线回归方程,得木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素回归方程分别为:Y1=11 381X1-121.98(r=0.999 9),线性范围0.054～10.85 μg·mL-1;Y2=17 149X2-422.28(r=0.999 9),线性范围0.659～72.44 μg·mL-1;Y3=25 628X3+607.15(r=0.999 5),线性范围0.010～10.42 μg·mL-1;Y4=21 425X4-887.50(r= 0.999 9),线性范围0.021～10.59 μg·mL-1;Y5= 28 342X5-2 552.60(r=0.999 3)线性范围0.125～12.46 μg·mL-1。结果表明各成分在各自浓度范围内线性关系良好。当信噪比为3∶1和10∶1时,测得木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的检出限分别为0.006,0.067,0.001, 0.002,0.013 μg·mL-1;测得木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的定量限分别为0.021,0.214,0.004,0.007,0.046 μg·mL-1。

2.1.5 精密度实验 取同一混合对照品溶液,在上述色谱条件下连续进样6次,木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素含量的RSD分别为1.00%,0.75%,0.35%,1.10%,0.82%,表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性实验 取同一批样品1 g,6份,按供试品溶液的制备法制备并进样测定洋甘菊中5种化学成分含量,RSD分别为1.10%,0.44%,0.37%,1.20%, 1.30%,表明本方法重复性良好。

2.1.7 稳定性实验 取“2.1.6”项下同一供试品溶液在室温下0,2,4,6,8,10,12 h分别进样测定。结果,12 h内洋甘菊中5种化学成分色谱峰面积无明显变化,RSD分别为0.96%,0.25%,0.76%,1.10%, 0.48%,表明被测样品在12 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品约0.5 g,共9份,分为3组,按低、中、高浓度分别加入木犀草苷等5种对照品储备液,按“2.1.3”项方法制备供试品溶液,进样测定,计算加样回收率,木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的加样回收率分别为99.7%,97.5%,98.8%, 100.9%,99.1%,RSD分别为1.8%,0.6%,0.5%, 1.8%,1.9%。

2.2 校正因子测定及相对保留时间考察

2.2.1 校正因子的测定 将已知浓度的芹苷元-7-葡萄糖苷、木犀草苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素对照品混合溶液按低、中、高浓度1,1.5,2 μL(n=3)注入超高效液相色谱仪,记录色谱图,以芹菜素色谱峰为内标,计算相对响应值作为校正因子。结果表明:芹苷元-7-葡萄糖苷、木犀草苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素对照品对芹菜素对照品的相对校正因子分别为1.441,2.308,1.117,1.490。结果见表2。

表2 校正因子测定Tab.2 Determination on correction factor

2.2.2 相对保留时间的考察 本研究考察了Waters Acquity UPLC,Waters alliance HPLC液相色谱系统,使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm× 50 mm,1.7 μm),Agilent(4.6 mm×250 mm,5 μm), Atlantic(4.6 mm×250 mm,5 μm),Phenomenex (4.6 mm×250 mm,5 μm)4种不同品牌和型号的色谱柱。取混合对照品溶液,注入液相色谱仪,测定,以芹菜素为内标物,计算木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的校正因子和相对保留值,结果见表3。

2.3 待测组分色谱峰的定位 本研究采用木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素与内标物芹菜素的相对保留值作为色谱峰定位标准,并考察了其在不同品牌仪器和不同规格色谱柱上的重复性。结果表明相对保留值波动较小,木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素相对芹菜素的平均值分别为0.257,0.385,0.684,0.73,RSD分别为1.2%,0.3%,0.19%,0.07%。因此本研究选用相对保留值作为目标色谱峰的定位指标比较合适。并且在此色谱条件下各批洋甘菊样品的色谱峰相对简单,因此在实际应用“一测多评”法时,可参考药材典型色谱图,利用相对保留值定位,根据内标物芹菜素的保留时间,通过相对保留值结合木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素色谱峰的紫外吸收特征,能够正确判断目标峰的准确峰位置。

2.4 一测多评法与外标法测定结果的比较 采用外标法和一测多评法,以“2.1.1”项色谱条件对11批洋甘菊中5种化学成分木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素进行含量测定。结果见表4。结果显示,两种方法所得含量值差异无统计学意义。说明一测多评法可用于洋甘菊的多成分质量评价研究。

3 讨论

本实验在对照品溶液的制备过程中发现,芹苷元-7-葡萄糖苷、芹菜素、木犀草苷对照品不易溶于甲醇,故在制备过程中先溶于适量N-N二甲基甲酰胺后再用甲醇稀释。

一测多评法与外标法测定结果的相对偏差＜0.5%,表明上述两种方法差异无统计学意义,说明本实验中建立的以芹菜素对照品为内标的一测多评法具有可行性,只需用芹菜素对照品,即可进行多指标同步测定,可替代外标测定法用于两种洋甘菊的质量分析。本实验中尤其木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷价格昂贵,以两种洋甘菊中均含成分、价格相对便宜的芹菜素为内标,同时测定木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的含量,从而实现以一种对照品对多个成分进行质量控制,在质量评价中,能较大降低测定成本。本实验选用UPLC色谱系统一测多评法同时分析5种成分,分离效果较HPLC更好,分离时间更短。

表3 相对保留时间考察Tab.3 Test on relative retention time

表4 外标法和QAMS测定洋甘菊中木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的含量Tab.4 Content determination on galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin in Chamomiles by external standard method and QAMS mg·g-1,n=2

《美国药典》中测定芹苷元-7-葡萄糖苷的含量,同时规定7-甲氧基香豆素,芹菜素,顺式螺醚、反式螺醚的相对保留时间。本实验中以芹菜素为对照,同时测定木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的含量,更适用于中药材的质量控制。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.025

Determination of Five Compounds from Two Species of Chamomiles from Xinjiang by QAMS

LI Jian-guang1,HAN Song-lin1,2,ZHAO Dong-sheng3,ZHANG Hai-bo1,GENG Jing1,LI Xin-xia1
(1. Pharmaceutical College,Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China;2.AKSu Vocational And Technical College,AKSu 843000,China;3.Xinjiang Bill Brother Biotechnology Company.,LTD,Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo establish a method of simultaneously quantitative analysis for multi-components by single marker(QAMS)of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin in two species ofChamomilesfromXinjiang.MethodsBy using apigenin as the internal standard,the relative correction factors(RCF)of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin and luteolin were set and determined by UPLC.The contents of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin in 11 samples ofChamomileswere authentically determined by the external standard method,to verify the accuracy of QAMS.ResultsThere is a good linear relationship within the range of standard curve for five compounds by the external standard method(r>0.999 3);the average recovery was 99.7%,97.5,98.8%,100.9%,99.1%,for galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin,respectively,with RSD as 1.8%,0.6%,0.5%, 1.8%and 1.9%,respectively.The RCF for pigenin-7-glucoside,galuteolin,7-methoxycoumarin and luteolin to apigenin was 1. 441,2.308,1.117,1.490,respectively,with RSD as 0.07%,0.04%,0.09%and 0.18%,respectively.No significant difference between the quantitative results by QAMS and external standard method was observed.ConclusionIt is practical to determine content of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin with RCF and apigenin by using external standard method,for the deficiency and expensive of the standard reference.

Chamomile;Roman chamomile;UPLC;Quantitative analysis of multi-components by single marker

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)11-1491-05

2013-10-25

2013-12-02

*新疆维吾尔自治区科技厅高技术研究项目(201316102);新疆医科大学2011-2012学年博士(后)科研启动金配套资助项目

李建光(1977-),男,新疆乌鲁木齐人,副教授,博士,主要从事药物分析与天然药物化学研究。电话:0991-4361362,E-mail:L77117@163.com。

李新霞(1968-),女,新疆乌鲁木齐人,教授,博士,主要从事分析测试技术与新药研发工作。电话:0991-4365034,E-mail:lxx6668@163.com。