3-羟基丁酸衍生物对PC12细胞凋亡的保护作用*

邹湘辉,刘博聪,2,庄东红,查广才,吴云影

(1.韩山师范学院生物系,潮州 521041;2.汕头大学生物系,汕头 515063)

3-羟基丁酸衍生物对PC12细胞凋亡的保护作用*

邹湘辉1,刘博聪1,2,庄东红1,查广才1,吴云影1

(1.韩山师范学院生物系,潮州 521041;2.汕头大学生物系,汕头 515063)

目的 观察3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯对PC12缺血清诱导凋亡细胞的保护作用。方法化学法降解聚羟基丁酸酯制备3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯。培养PC12细胞,以含血清培养组细胞为阴性对照组,缺血清培养组细胞为阳性对照组,以在缺血清条件下添加不同浓度3-羟基丁酸甲酯或3-羟基丁酸乙酯细胞为样品组,通过形态学观察法、噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞形态及活性变化。结果与阴性对照组比较,阳性对照组细胞出现大量凋亡,形态变小变细,活性降低。样品处理组细胞活性不同程度提高,低浓度(0.01和0.001 mg·mL-1)3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯对凋亡细胞有保护作用,浓度为1 mg·mL-1时效果最好。结论通过化学法能够制备高纯度3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯,上述两种样品对缺血清诱导凋亡的PC12细胞有保护作用。

3-羟基丁酸;3-羟基丁酸甲酯;3-羟基丁酸乙酯;PC12细胞;细胞凋亡

3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯是3-羟基丁酸衍生物,3-羟基丁酸是人体脂肪酸代谢后产生的3种酮体之一,通常人体血液和组织中浓度约0.1 mmol·L-1,在糖饥饿情况下可以作为脑部的一种应急性能源使用[1]。已有研究表明,3-羟基丁酸与糖尿病、体内能量代谢紊乱等有着密切联系[2]。在以往的研究中发现,聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)在组织工程和材料学方面具有十分突出的应用潜力,目前PHA的主要应用是作为一种环境友好型生物可降解塑料。3-羟基丁酸作为高分子PHA的一种最普遍的降解产物,受到越来越多的关注[3],3-羟基丁酸和通过对聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)进行醇解衍生化生成3-羟基丁酸甲酯和-3羟基丁酸乙酯能够促进神经胶质细胞、成骨细胞等的生长[3]。笔者前期的工作发现,3-羟基丁酸及其衍生物具有增强大鼠脑部神经递质表达和提高大鼠认知功能的作用[4]。笔者在本实验中采用缺血清诱导PC12细胞凋亡,研究3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯对凋亡细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂及设备 PHB(清华大学生命科学学院微生物实验室提供,该材料为其实验室微生物发酵产物,纯度:97.5%);达尔伯克必需基本培养液(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)高糖培养液(批号: 1154412)购自美国Gibco公司;噻唑蓝(thiazole blue, MTT,批号:C18H16N5SBr)购自美国Sigma-Aldrich公司;胎牛血清购自四季青公司(批号:130620);二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自天津希恩思公司; Shimadzu气质联用(GasChromatograph-Mass Spectrometer,GC-MS)仪(GC-MSQP5050A);OLYMPUS 1X7/1X51倒置显微镜。

1.2 3-羟基丁酸甲酯及3-羟基丁酸乙酯的制备及鉴定 称取PHB 5 g,溶于50 mL三氯甲烷,转移至圆底烧瓶。安装上水浴冷凝管,并放入恒温水浴锅,缓慢加热搅拌溶解。另量取甲醇100 mL放入150 mL锥形瓶,同时加入浓硫酸2 mL常温搅拌混合,将上述乙醇-浓硫酸溶液加入PHB三氯甲烷溶液圆底烧瓶,混合。温度控制在约90℃。反应时间48 h。反应结束后,抽滤除杂。将滤液转移至250 mL分液漏斗,加入纯化水25 mL,静置分层,收集下层有机相,加入5%碳酸氢钠(NaHCO3)25 mL中和1次,纯化水25 mL洗涤1次,分液漏斗分离,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤出硫酸钠。有机相用旋转蒸发仪蒸发三氯甲烷并干燥,减压蒸馏得到产物。通过以上过程制备的产物用GC-MS分析其组成和比例。

3-羟基丁酸乙酯制备及鉴定与3-羟基丁酸甲酯制备方法相同,将其中的甲醇更换成乙醇。通过以上过程制备的产物用GC-MS分析其组成和比例。

1.3 PC12细胞的培养及损伤模型的建立 PC12细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液于37℃、5%二氧化碳(CO2)细胞培养箱中培养,当细胞覆盖瓶底面积约80%时,0.25%胰蛋白酶消化离心,完全培养液重悬后进行继代培养。取对数期生长期细胞用于分组实验。

阴性对照组更换新鲜含5%胎牛血清的高糖DMEM培养液,阳性对照组更换新鲜不含血清的DMEM高糖培养液,3-羟基丁酸甲酯保护组更换新鲜不含胎牛血清但3-羟基丁酸甲酯终浓度为1,0.1, 0.01,0.001 mg·mL-1DMEM高糖培养液,3-羟基丁酸乙酯保护组更换新鲜不含胎牛血清但3-羟基丁酸乙酯终浓度为1,0.1,0.01,0.001 mg·mL-1DMEM高糖培养液。继续培养24 h。

1.4 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察各组细胞形态并摄像。

1.5 MTT法检测细胞活性 各组细胞每孔加入5 mg·mL-1MTT 20 μL,孵育4 h后去上清液,每孔加入DMSO 150 μL,水平摇床震荡10 min,酶标仪[芬兰/雷勃(美国热电),型号:Multiskan MK3]492 nm波长下测定吸光度(A)值,调零孔加入DMSO 150 μL为空白对照。

2 结果

2.1 PHB醇解产物的鉴定分析 通过醇解PHB制得3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯,经过GC-MS检测后各产物鉴定分析结果见图1,2和表1,2所示。

1.3-羟基丁酸乙酯;2.3-羟基丁酸乙酯图1 PHB乙醇解产物GC-MS分析1.ethyl-3-hydroxybutyrate;2.ethyl-3-hydroxybutyrateFig.1 GC-MS analysis on ethanolysis product of PHB

表1 PHB乙醇解产物成分Tab.1 Component of ethanolysis product of PHB

1.3-羟基丁酸甲酯;2.3-羟基丁酸甲酯图2 PHB甲醇解产物GC-MS分析1.methyl-3-hydroxybutyrate;2.methyl-3-hydroxybutyrateFig.2 GC-MS analysis on methanolysis product of PHB

表2 PHB甲醇解产物成分Tab.2 Component of methanolysis product of PHB

由表1,2可以看出,通过醇解方法对PHB进行降解可以制备高纯度3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯,产物在GC-MS分析下分别有两个不同的出峰时间。查阅数据库后分析可知,是制备过程中同种产物出现左旋和右旋两种不同构型形成的。

2.2 细胞形态 见图3,4。阴性对照组细胞长势良好,单个细胞呈现粗壮多变性,有3或4个突起,折光性高,细胞生长均匀且密度较大。阳性对照组细胞呈细丝线形或圆形欲浮起状,两端无法看见类似阳性对照组细胞的突起,折光性低,细胞生长不均匀且密度较小。在两种样品实验组中可以看出在各个剂量下的细胞形态与阳性对照比较较粗壮,折光性恢复,无明显细胞突起,但细胞数目明显较模型对照组多。在3-羟基丁酸甲酯保护组中,0.01 mg·mL-13-羟基丁酸甲酯组细胞形态较阳性对照组有较大变化,细胞宽度明显加大,少数细胞还能观察到细胞突起存在,折光性较好。1 mg·mL-13-羟基丁酸乙酯保护组细胞宽度加大,折光性好,细胞突触数量多,细胞数目也较阳性对照组多。

2.3 细胞活性检测 经过缺血清诱导处理后,阳性对照组细胞活性较阴性对照组差,而添加了不同剂量3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯的细胞活性均有不同程度提高,3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯在1 mg·mL-1时均呈现出最好的保护作用,剂量为0.1 mg·mL-1时保护作用不明显,剂量为0.01和0.001 mg·mL-1时均具有一定保护作用(表3)。

3 讨论

3-羟基丁酸是最普遍的PHA降解产物,近年来对于3-羟基丁酸的生理作用的研究逐渐增多,包括为大脑提供能量[3],作为脑的谷氨酸抑制性神经递质(γ-氨基丁酸)的代谢前体物[4],和作为细胞凋亡的抑制剂作用等[5]。目前利用生物方法来进行3-羟基丁酸及其衍生物的合成很困难,且有关3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯在PC12细胞凋亡保护方面的研究还未见报道。笔者通过化学降解法成功制备得到3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯,具有很高的得率,再利用GC-MS对产物进行检测,发现产物的纯度也比较高,化学法降解PHA制备3-羟基丁酸衍生物作为一种简单的制备手性药物分子的途径具有推广利用的价值。

A.阴性对照组;B.阳性对照组;C.1 mg·mL-13-羟基丁酸乙酯组;D.0.1 mg·mL-13-羟基丁酸乙酯组;E.0.01 mg·mL-13-羟基丁酸乙酯组;F.0.001 mg·mL-13-羟基丁酸乙酯组图4 3-羟基丁酸乙酯对缺血清诱导细胞凋亡保护作用A.negative control group;B.positive control group;C.1 mg·mL-1Ethyl-3-hydroxybutyrate group;D.0.1 mg·mL-1Ethyl-3-hydroxybutyrate group;E.0.01 mg·mL-1Ethyl-3-hydroxybutyrate group;F.0.001 mg·mL-1Ethyl-3-hydroxybutyrate groupFig.4 Protection of ethyl-3-hydroxybutyrate on the apoptosis of PC12 induced by FBS deficiency

表3 3-羟基丁酸衍生物对PC12细胞活性影响分析Tab.3 Effect of derivate of 3-hydroxybutyrate on the activity of PC12 cells ±s

表3 3-羟基丁酸衍生物对PC12细胞活性影响分析Tab.3 Effect of derivate of 3-hydroxybutyrate on the activity of PC12 cells ±s

与阳性对照组比较,*1P＜0.05Compared with positive control group,*1P＜0.05

组别吸光度值(A492nm)组别吸光度值(A492nm)阴性对照组0.176±0.008*1,χ2=4.017阴性对照组0.127±0.003*1,χ2=3.115阳性对照组0.112±0.002阳性对照组0.087±0.001 1 mg·mL-13-羟基丁酸甲酯组0.149±0.007*1,χ2=3.3231 mg·mL-13-羟基丁酸乙酯组0.122±0.003*1,χ2=3.634 0.1 mg·mL-13-羟基丁酸甲酯组0.106±0.004,χ2=0.5680.1 mg·mL-13-羟基丁酸乙酯组0.086±0.003,χ2=0.115 0.01 mg·mL-13-羟基丁酸甲酯组0.127±0.003*1,χ2=2.1190.01 mg·mL-13-羟基丁酸乙酯组0.105±0.003*1,χ2=2.616 0.001 mg·mL-13-羟基丁酸甲酯组0.141±0.003*1,χ2=3.1350.001 mg·mL-13-羟基丁酸乙酯组0.118±0.004*1,χ2=3.213

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株,在正常情况下PC12细胞在形态上和生理生化上与肾上腺髓质细胞相似,而在培养物中添加神经生长因子(nerve growth factor,NGF)后,PC12细胞具有神经细胞的形态和相类似的代谢产物形成[9],目前PC12细胞正被广泛地应用于研究各种作用于神经细胞的分化、受体及神经递质释放等的中枢神经系统药物的作用机制。细胞凋亡在20世纪70年代首先由HERR等[10]提出,细胞凋亡在组织和器官的发育或者多种病变过程中起着重要的作用。神经细胞凋亡是许多中枢神经系统疾病发生的最终原因,诸如老年痴呆症、帕金森病和低氧缺血性脑损伤等,而在体外细胞培养过程中模型细胞凋亡的方式有很多种,缺血清诱导细胞凋亡是其中比较简便且行之有效的方法之一,具体做法是去除培养液中的血清,使细胞在一定时间内处于无血清培养状态,细胞因缺乏必要的生长因子和营养物质而发生凋亡[11]。本研究发现,PC12细胞缺血清诱导凋亡组与正常的含血清培养组比较,细胞形态变化明显,活性降低,凋亡增加,而在添加了不同浓度3-羟基丁酸甲酯或者3-羟基丁酸乙酯的实验组中,极低浓度的3-羟基丁酸甲酯和3-羟基丁酸乙酯都可以抑制缺血清诱导的PC12细胞凋亡,细胞数目增加,对细胞形态具有一定的修复作用,细胞活性显著增强,高浓度组细胞的活性可达到与阴性对照组接近。推测这两种小分子可能在低浓度时作为某一种信号分子启动了细胞内抑制细胞凋亡基因的表达,在较高浓度时同时启动了凋亡基因的表达而表现出对细胞的保护作用减弱,但是随着浓度的进一步升高,可作为营养成分促进细胞的生存,详细机制还有待进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.007

Protective Effect of 3-hydroxybutyrate Derivate on the Apoptosis of PC12

ZOU Xiang-hui1,LIU Bo-cong1,2,ZHUANG Dong-hong1,ZHA Guang-cai1,WU Yun-ying1
(1.Department of Biology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China;2.Department of Biology,Shantou University, Shantou 515063,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of 3-hydroxybutyratederivate(methyl-3-hydroxybutyrateand ethyl-3-hydroxybutyrate)on the apoptosis of PC12 induced by FBS deficiency.MethodsMethyl-3-hydroxybutyrateand ethyl-3-hydroxybutyratewere prepared by chemical degradation.PC12 cells were divided into different groups:medium with FBS as negative control,medium without FBS as positive control,medium with different concentrations of methyl-3-hydroxybutyrateor ethyl-3-hydroxybutyratewithout FBS as sample groups.The shape and viability of cells in each group were analyzed by optical microscope and MTT.ResultsCompared with the negative control,cells in the positive control group demonstrated a large number of apoptosis,smaller and thinner morphology,and lower activity.However,the activity of cells was improved in the sample groups.Low concentration(0.01 and 0.001 mg·mL-1)of methyl-3-hydroxybutyrateand ethyl-3-hydroxybutyrateshowed a protective effect on cell apoptosis,and 1 mg·mL-1had the best protection effect.ConclusionHigh purity methyl-3-hydroxybutyrateand ethyl-3-hydroxybutyratecan be produced by chemical method,and both chemicals present good effect on protecting the PC12 from apoptosis.

3-hydroxybutyrate;Methyl-3-hydroxybutyrate;Ethyl-3-hydroxybutyrate;PC12 cell;Apoptosis

R977;R965

A

1004-0781(2014)11-1427-04

2013-09-27

2013-10-25

*广东省自然科学基金博士启动项目(10452104101004655);韩山师范学院青年基金项目(LQ200801)

邹湘辉(1976-),男,湖南衡阳人,副教授,博士,主要研究方向:细胞生物学。E-mail:zxh11043@126.com。