左氧氟沙星4种晶型的大鼠体内药动学研究*

吴媛媛,靳桂民,杜冠华,吕扬,戴贵东

(1.宁夏医科大学药学院药理系,银川 750001;2.北京协和医学院、中国医学科学院药物研究所,北京100050)

左氧氟沙星4种晶型的大鼠体内药动学研究*

吴媛媛1,靳桂民2,杜冠华2,吕扬2,戴贵东1

(1.宁夏医科大学药学院药理系,银川 750001;2.北京协和医学院、中国医学科学院药物研究所,北京100050)

目的 研究左氧氟沙星4种晶型在SD大鼠体内药动学差异,评价其优势药用晶型,探讨药物晶型物质状态对临床用药的影响。方法SD大鼠灌胃给予不同晶型左氧氟沙星固体原料药,高效液相色谱法测定血左氧氟沙星浓度,非房室模型计算大鼠体内药动学参数并在不同晶型之间进行比对。结果大鼠灌胃给予左氧氟沙星晶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型后,血液中峰浓度(Cmax)分别为6.984,9.692,9.405,6.424 mg·L-1;达峰时间(tmax)分别为0.6,0.9,1.0,1.0 h;半衰期(t1/2)分别为4.207,2.970,4.857,1.695 h;药-时曲线下面积(AUC(0→12h))分别为31.478,42.385,32.406,31.636 mg·h·L-1。结论大鼠口服不同晶型左氧氟沙星后,利用专业软件DAS 3.0对测得的血药浓度数据进行药动学参数计算,左氧氟沙星4种晶型未发现差异有统计学意义,但检测结果表明晶Ⅱ型血药浓度最高,血药浓度维持时间长,可能作为优势药用晶型用于产品生产。

左氧氟沙星;多晶型;药动学;色谱法,高效液相

左氧氟沙星为第三代氟喹诺酮类抗菌药物,是氧氟沙星(消旋体)中具有抗菌活性的S(-)型光学对映体,经拆分获得的单一异构体(图1),抗菌活性是氧氟沙星的2倍,不良反应发生率仅为氧氟沙星的1/3。其药动学特征为血浆消除半衰期较长,在组织中分布广泛,主要以原型从尿中排泄[1]。与氧氟沙星相比,具有抗菌谱广、抗菌作用强等特点,在临床上得到广泛应用。《中华人民共和国药典》2010年版二部收载了左氧氟沙星的质量标准[2]。

图1 左氧氟沙星化学结构式Fig.1 Chemical structure formula of levofloxacin

近年来,药物的多晶型已经成为国内外药学领域的研究热点[3-7]。固体化学物质多晶型现象(polymorphism),又称同质异晶现象,是指由于分子结构的构型、构象、分子排列、分子作用力、共晶物质等各种因素影响,存在2种或多种分子排列状态,形成不同的物质存在状态[8]。固体药物由于多晶型自由能之间差异以及分子间作用力不同,导致样品的溶解度有差异,可造成药物生物利用度不同,从而影响药物在体内的吸收,产生药效差异[9-10]。为研究不同左氧氟沙星晶型在大鼠体内的药动学特征,探讨左氧氟沙星不同晶型对口服吸收的影响,笔者在本实验建立测定血浆左氧氟沙星浓度方法,同时探索大鼠灌胃左氧氟沙星4种晶型在体内吸收上的差异,并筛选出其中的优势药用晶型。

1 材料与仪器

1.1 试剂 左氧氟沙星4种晶型样品(中国医学科学院药物研究所药物晶型研究中心提供,纯度均大于98%,批号:20130307),左氧氟沙星对照品(中国食品药品检定研究院,供含量测定用,批号:130455-201106),环丙沙星对照品(中国食品药品检定研究院,供含量测定用,批号:130451-201203)。甲醇、乙腈为色谱纯,水为纯化水,三乙胺、磷酸为分析纯。

1.2 实验动物 SPF级斯泼累格·多雷(Sprague Damley,SD)大鼠(♂),体质量(220±20)g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,合格证号:SCXK(京) 2009-0007。所有动物自由饮水及进食,自然照明,室温19～21℃,预养2 d后进行实验。

1.3 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(二级管阵列检测器,美国Agilent公司),Minispin离心机(德国Eppendorf公司),高速冷冻离心机(美国Backman公司),固体灌胃器(中国医学科学院药物研究所国家药物筛选中心研制),N-EVAP-TM111型氮吹仪(北京康林公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent TC-C18(2) (150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-0.025%磷酸水溶液(三乙胺调pH=3.3)(13∶87);流速1 mL·min-1;柱温35℃;进样量20 μL;检测波长299 nm;内标为环丙沙星。

2.2 对照品溶液及内标溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制 取左氧氟沙星对照品适量精密称定,用流动相溶解并配制成1.0 mg·mL-1溶液。以流动相为溶剂,将该溶液倍比稀释成2.0,10, 25,50,100,250,500 μg·mL-1系列浓度对照品溶液,于4℃冰箱避光贮存备用。

2.2.2 内标溶液的配制 取环丙沙星对照品适量精密称定,用流动相溶解并配制成1.0 mg·mL-1溶液。以流动相为溶剂,将该溶液稀释成10 μg·mL-1内标溶液,于4℃冰箱避光贮存备用。

2.3 血浆样品的处理

2.3.1 空白血浆的处理 取空白血浆200 μL,置于1.5 mLEP管,加入甲醇400 μL,振荡混匀3 min,以13 400 r·min-1离心10 min,取全部上清液,氮气(N2)吹干,加流动相100 μL复溶,振荡混匀3 min, 13 400 r·min-1离心10 min,吸取上清液50 μL,用作HPLC分析。

2.3.2 血浆样品处理方法 取血浆样品150 μL,置1.5 mL离心管,加入内标溶液50 μL,涡旋混匀。然后按照“空白血浆处理方法”同法处理。

2.4 专属性实验 采用“2.3”项血浆样品的处理方法,按“2.1”项色谱条件,对空白血浆(A)、空白血浆+左氧氟沙星(1 μg·mL-1)+环丙沙星(B)以及给药后2 h的血浆样品+环丙沙星样品(C)进行测定。在设定条件下,血浆中的内源性物质不干扰左氧氟沙星和环丙沙星的测定,且左氧氟沙星与内标物分离度良好,说明该法具有良好的专属性。HPLC分析结果见图2。

2.5 标准曲线的绘制 取空白血浆180 μL,加入系列浓度的左氧氟沙星对照品溶液20 μL,配制成终浓度分别为0.2,1.0,2.5,5.0,10.0,25.0, 50.0 μg·mL-1血浆样品,按“2.3”项血浆样品的处理方法进行处理,利用对照品峰面积与内标峰面积比(Areas/Areai)对对照品浓度(C)作线性回归(图3),得出相应回归方程为:Y=0.280 6X+0.036 2,R2= 0.999 8(n=5),表明左氧氟沙星血浆样品在0.2～50.0 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.6 检测限与定量限 以信噪比S/N=3作为最低检测限,信噪比S/N=10作为最低定量限,结果本研究方法的检测限为0.08μg·mL-1,定量限为0.2 μg·mL-1。

2.7 精密度实验 取SD大鼠空白血浆180 μL,精密加入对照品溶液20 μL,使终浓度分别为0.2,2.5和10 μg·mL-1,然后分别加入内标工作液50 μL,按照“2.3”项血浆样品的处理方法进行处理,用Areas/ Areai作为指标,考察日内和连续3 d(1 d内重复5次)的日间变异情况。结果显示左氧氟沙星的日内和日间精密度良好(表1)。

2.8 回收率实验

2.8.1 萃取回收率 取SD大鼠空白血浆180 μL,精密加入对照品溶液20 μL,使终浓度浓度分别为0.2, 2.5和10 μg·mL-1,然后分别加入内标工作液50 μL,按“2.3”项血浆样品的处理方法进行处理,利用血浆样品的峰面积与对照品峰面积比值,计算得出萃取回收率,重复5次,结果见表2。

A.空白血浆;B.空白血浆+左氧氟沙星+环丙沙星;C.给药后2 h血浆+环丙沙星;1.左氧氟沙星;2.环丙沙星图2 3种血浆样品HPLC图A.blank plasma;B.blank plasma spiked with levofloxacin and ciprofloxacin;C.blood sample at 2h from rat spiked with ciprofloxacin;1.levofloxacin;2.ciprofloxacinFig.2 HPLC chromatograms of three kinds of plasma sample

2.8.2 方法回收率 取SD大鼠空白血浆180 μL,精密加入对照品溶液20 μL,使终浓度浓度分别为0.2, 2.5和10 μg·mL-1,分别加入内标工作液50 μL,按“2.3”项血浆样品的处理方法进行处理,利用血浆样品的峰面积与内标峰面积的比值,代入线性方程,计算检出量,检出量与加入量的比值即为方法回收率,重复5次,结果见表2。

图3 左氧氟沙星标准曲线Fig.3 Standard curves for Levofloxacin

左氧氟沙星萃取回收率均>90.0%,方法回收率均值102.3%,表明本研究采用的方法准确度良好。

2.9 左氧氟沙星不同晶型大鼠灌胃吸收实验 将SD大鼠随机编号并分为4组,每组6只,禁食12 h,按100 mg·kg-1给予左氧氟沙星不同晶型固体原料药,于给药后5 min,15 min,30 min,1 h,1.5 h,2 h,3 h, 4 h,6 h,8 h,10 h,12 h眼内眦静脉取血约450 μL,加至预先加入肝素并低温干燥的EP管,以5 000 r·min-1高速冷冻离心10 min,分离得到血浆样品。按“2.3”项血浆样品处理方法进行处理并进行分析。计算左氧氟沙星血浓度,绘制血药浓度-时间曲线,结果见图4。

表1 左氧氟沙星血浆样品的日内和日间精密度Tab.1 Intra-day and inter-day precision for levofloxacin in plasma %,±s,n=5

表1 左氧氟沙星血浆样品的日内和日间精密度Tab.1 Intra-day and inter-day precision for levofloxacin in plasma %,±s,n=5

加样浓度/ (μg·mL-1)日间(n=5)回收率RSD日内(n=5)回收率RSD 0.2103.7±2.82.798.9±9.29.3 2.591.6±1.11.2102.2±4.64.5 1097.4±3.83.9102.6±4.03.9

表2 左氧氟沙星血浆样品的回收率实验结果Tab.2 Recovery of levofloxacin in plasma %,±s,n=5

表2 左氧氟沙星血浆样品的回收率实验结果Tab.2 Recovery of levofloxacin in plasma %,±s,n=5

加样浓度/ (μg·mL-1)提取回收率回收率RSD方法回收率回收率RSD 0.299.4±3.23.2101.4±4.34.2 2.590.4±3.64.0106.5±5.45.1 1092.2±4.65.098.9±4.95.0

图4 左氧氟沙星不同晶型的药时曲线Fig.4 Plasma concentration-time profiles of levofloxacin polymorphs after administration(p.o.)of 100 mg·kg-1in rats(±s,n=6)

2.10 主要药动学参数 利用专业软件DAS 3.0对测得的血药浓度数据计算药动学参数(非房室模型法),主要参数结果见表3。研究发现,左氧氟沙星的4种晶型未发现差异有统计学意义,但检测结果表明晶Ⅱ型血药浓度最高,血药浓度维持时间长,提示不同晶型物质可能有不同的临床效果。

3 讨论

与已有研究的给药方式不同[11],本实验采用了固体给药方式,用大鼠固体灌胃器将不同晶型物质给予大鼠。此方法既避免了由于药物混悬而造成的药物晶型破坏,从而保证药物以特定的晶型形式进入动物体内,又很好地模拟了固体口服药物在生物体内的溶解释放和吸收过程,因此是一种科学的晶型药物给药方式。样品前处理方法与已有相关研究不同[12-14],笔者在本实验使用了甲醇沉淀法,甲醇样品经N2吹干浓缩,再用流动相复溶,该方法优点是回收率高、适用性强,操作简便,且方法的精确度和准确度都符合有关规范要求。

已有研究发现药物的不同晶型之间治疗效果存在较大的差异[15-16],不同厂家生产的左氧氟沙星质量亦存在较大差异[17-20],其中药物制剂生产过程中使用的原料药缺乏多晶型的研究与质量控制是重要的影响因素。因此,提高仿制药物的疗效,必须重视药物的物质状态研究,通过筛选优势药物晶型来减小与专利药的疗效差异[18]。该研究结果可应用于左氧氟沙星固体制剂生产过程,对其原料药进行晶型鉴定和晶型质量控制;对已上市的左氧氟沙星固体制剂应进行多晶型研究和药品品质再评价。

本实验建立了一种检测大鼠血浆中左氧氟沙星浓度的高效液相色谱方法,并利用该方法对左氧氟沙星多晶型大鼠体内药动学进行考察,尽管左氧氟沙星4种晶型的药动学参数在统计学上并未发现差异有统计学意义,但实验结果显示4种晶型的一些区别,其中晶Ⅱ型作为优势药用晶型可能会在临床上表现出更好的疗效。

表3 左氧氟沙星多晶型在大鼠体内的血浆药动学参数Tab.3 Pharmacokinetic parameters of levofloxacin polymorphs in plasma of rats ±s,n=5

表3 左氧氟沙星多晶型在大鼠体内的血浆药动学参数Tab.3 Pharmacokinetic parameters of levofloxacin polymorphs in plasma of rats ±s,n=5

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.002

Study on Pharmacokinetics of Levofloxacin Polymorphs in Rats

WU Yuan-yuan1,JIN Gui-min2,DU Guan-hua2,LYU Yang2,DAI Gui-dong1
(1.Department of Pharmacology, School of Pharmacy,Ningxia Medical University,Yinchuan 750001,China;2.Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

ObjectiveTo study the pharmacokinetics difference of levofloxacin polymorphs in rats,evaluate the advantageous medical polymorph,and explore the effects of different polymorphs on clinical medicine.MethodsFour crystal forms of levofloxacin were administered intragastrically to rats,and high performance liquid chromatography(HPLC)was used to measure the contents of levofloxacin in rat plasma.The pharmacokinetic parameters were calculated and comparedResultsAfter a single oral dose,the peak plasma concentration(Cmax)of crystal forms ofⅠ,Ⅱ,ⅢandⅣof levofloxacin was 6.984,9.692,9. 405,6.424 mg·L-1;the time to peak(tmax)was 0.6,0.9,1.0,1.0 h;the half-life(t1/2)was 4.207,2.97,4.857,1.695 h; the area under the curve(AUC0→12h)was 31.478,42.385,32.406,31.636 mg·h·L-1.ConclusionThere is no statistically significant difference in pharmacokinetic parameters.However,compared with other crystal forms,plasma concentration of crystal form II is higher and maintained longer.Therefore,crystal form II of levofloxacin is an advantageous polymorph for medicine.

Levofloxacin;Polymorphs;Pharmacokinetics;HPLC

R978.1;R965

A

1004-0781(2014)11-1407-05

2014-03-26

2014-04-27

*重大新药创制十二五规划项目(2012ZX09301002-001-013,2013ZX09102110);卫生部行业基金(200902008)

吴媛媛(1979-),女,河北唐山人,在读硕士,研究方向:药理学。电话:010-84439596,E-mail:cser_mars@126. com。

杜冠华(1956-),男,山东滕州人,研究员,博士生导师,从事药物发现、高通量药物筛选、神经药理学和心脑血管药理学研究。电话:010-63165184,E-mail:dugh@imm.ac.cn。