松生等总黄酮提取工艺及镇痛抗炎作用研究*

金岩,黄山,赵磊,裴小娜

[1.青岛科技大学化工学院药学系,青岛 266042;2.甘肃中医学院甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室,兰州 730000]

松生等总黄酮提取工艺及镇痛抗炎作用研究*

金岩1,黄山1,赵磊2,裴小娜1

[1.青岛科技大学化工学院药学系,青岛 266042;2.甘肃中医学院甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室,兰州 730000]

目的 研究松生等总黄酮的最佳优化提取工艺,并对不同极性溶剂提取部分的镇痛抗炎作用进行研究。方法通过单因素实验和正交实验,考察提取时间、料液比、乙醇浓度和提取次数对松生等总黄酮提取率的影响;采用小鼠冰醋酸扭体法及二甲苯致小鼠耳肿胀模型筛选松生等不同溶剂提取部分镇痛抗炎作用。结果回流提取法提取松生等总黄酮的最佳条件为:提取时间3 h、料液比1∶30、乙醇浓度60%、提取2次,黄酮提取率最高5.63%;松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物均能够抑制冰醋酸引起的小鼠扭体反应和二甲苯引起的小鼠耳肿胀。结论该工艺提取松生等总黄酮提取率高,方法简便,重复性好。松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物均具有明显镇痛抗炎作用。

松生等;总黄酮;回流提取;镇痛;抗炎

松生等(Euphorbia prolifera)为鼠李科植物西藏猫乳(Rhamnella gilgiticaMansf.et Melch.)或小叶鼠李(Rhamnus parvifoliaBunge)的干燥木材[1]。原植物主产于我国,主要分布在西藏东南部、云南西北部、四川西南部,为我国藏族传统民间用药,具有凉血、祛风湿、抗炎、消肿止痛功能,用于治疗高山多血症、麻风病等疾病。但目前对该药研究较少,仅在20世纪90年代有少量文献记载其主要成分为黄酮类化合物[2-3]。笔者在本实验研究松生等总黄酮的最佳提取工艺,并通过冰醋酸诱导小鼠扭体实验模型和二甲苯诱导小鼠耳肿胀模型比较不同溶剂提取部分的镇痛抗炎作用。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 实验ICR小鼠,体质量(20±2)g,雌雄兼用,由青岛药物检验所提供,SPF级,生产许可证号:SCXK(鲁)2009007,使用许可证号:SYXK(鲁) 20092-009。

1.2 药物与试剂 松生等采自西藏芒康地区,由成都中医药大学龙飞副教授鉴定为鼠李科猫乳属植物西藏猫乳茎的干燥木质部;芦丁对照品购自中国食品药品检定研究院(含量≥98%,批号:100080-200707);乙醇(天津博迪化工股份有限公司,分析纯,批号: 20121019);冰醋酸(天津博迪化工股份有限公司,分析纯,批号:20120524);二甲苯(天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯,批号:20121103)。

1.3 仪器与设备 98-1-B型电子调温电热套(上海百申仪器设备有限公司);YP402N电子天平(北京京海正通科技有限公司);B-220恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司);P7021TP-6格兰仕微波炉(广东格兰仕集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的含量测定

2.1.1 标准曲线的绘制 取105℃减压干燥的芦丁对照品11.7 mg精密称定,乙醇溶解,定容至25 mL,摇匀,配成0.468 mg·mL-1芦丁对照品溶液。分别量取此溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,置25 mL量瓶,分别加水6 mL,后加5%亚硝酸钠1 mL,振摇后放置6 min,再加入10%硝酸铝1 mL。摇匀后静置6 min,最后加入4%氢氧化钠10 mL,加水至刻度,摇匀,静置15 min,在510 nm波长下测吸光度(UV-1000紫外可见分光光度计,北京莱伯泰科仪器有限公司)。以芦丁浓度(μg·mL-1)为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得线性回归方程为:A=12.759C-0.037 3,r= 0.999 5,表明芦丁在18.72～93.60 μg·mL-1呈良好线性关系。

2.1.2 供试品溶液的制备 取干燥至恒重的松生等干燥物100 mg,精密称定,置干燥小烧杯,加适量70%乙醇,加热溶解。用滤膜过滤溶液并将其转入25 mL量瓶,加超纯水定容,摇匀,即得供试品溶液。

2.2 单因素分析

2.2.1 料液比对提取率的影响 称取粉碎后的松生等5.0 g,以70%乙醇为提取剂,提取4 h,选择料液比1∶20,1∶30,1∶40,1∶50条件下进行回流提取实验,测定并计算相应条件下总黄酮得率,考察不同料液比对提取率的影响,结果见表1。

由表1可知,随料液比中乙醇量增加,黄酮浸出率也依次增加,当料液比为1∶30(g·mL-1)时,达到最高,乙醇量继续增加,黄酮浸出率有所下降,可能因为有大量杂质溶出,影响了黄酮浸出率,而且过大的料液比会造成溶剂和资源浪费,增加成本。综合考虑,确定料液比1∶30为最佳料液比。

表1 不同料液比对提取率的影响Tab.1 Effect of the ratio of material to liquid on extraction rate

2.2.2 提取时间对提取率的影响 称取粉碎后的松生等5.0 g,70%乙醇为提取剂,料液比为1∶30,提取时间分别为2,3,4,5 h,回流提取2次。研究不同提取时间对提取率的影响。见表2。

表2 提取时间对提取率的影响Tab.2 Effect of extraction time on extraction rate

由表2可知,提取率随提取时间的延长出现先增加后逐渐降低的现象,当提取时间为4 h时达到最大值。可能因为所含黄酮物质已基本析出,延长提取时间不能使提取率升高。另外,延长提取时间致使环境温度过高,部分乙醇溶剂挥发从而影响提取效果,因此选择提取时间4 h最佳。

2.2.3 乙醇浓度对提取率的影响 称取粉碎后的松生等5.0 g,料液比为1∶30,提取时间4 h,分别以50%,60%,70%,80%乙醇为提取溶剂进行回流提取实验,提取2次。结果见表3。

结果表明,随乙醇浓度增加,提取率先增加后减小,70%乙醇提取率最高,之后提取率下降,这可能是由于一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出增多,干扰因素随之增多,从而导致黄酮类化合物浸出率下降。所以最佳提取乙醇浓度为70%。

2.2.4 提取次数对提取率的影响 称取粉碎后的松生等5.0 g,以70%乙醇为提取剂、提取时间4 h、液料比1∶30条件下进行回流提取实验,测定并计算相应条件下总黄酮得率,考察提取次数对提取率的影响,结果见表4。

表3 乙醇浓度对提取率的影响Tab.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate %

表4 提取次数对提取率的影响Tab.4 Effect of extraction times on extraction rate

2.3 正交实验设计 根据上述单因素实验结果,选择料液比(A)、提取时间(B)、乙醇浓度(C)、提取次数(D)为考察因素,以总黄酮提取率为评价指标,采用L9(34)正交表对回流提取条件做进一步优选,因素水平见表5,实验结果及方差分析见表6,7。

表5 正交实验因素水平表Tab.5 Factors and levels of orthogonal test

由表6和表7可知,各因素对松生等总黄酮提取率影响顺序为提取时间>料液比>提取次数>乙醇浓度,其中提取时间为最主要影响因素,各因素最佳组合为A2B2C1D2,即加入60%乙醇溶液,料液比为1∶30,回流提取2次,提取时间3 h,所得提取率最高。

表6 L9(34)正交实验设计及结果Tab.6 Design and results of L9(34)orthogonal test

表7 正交实验方差分析表Tab.7 Variance analysis on orthogonal test

验证实验:精密称取松生等样品5.0 g,2份,按照A2B2C1D2条件回流提取,测得松生等中总黄酮的提取率为5.62%和5.64%,平均提取率5.63%。

2.4 松生等不同极性提取物镇痛抗炎作用研究

2.4.1 松生等不同极性提取物的制备 松生等去皮木部1 kg,75%乙醇3倍回流提取3次,滤过、回收乙醇提取液,得浸膏。将浸膏水溶液依次用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,直至萃取溶液无色为止,回收溶剂,即得不同溶剂的萃取物。

2.4.2 松生等不同提取物对冰醋酸所致小鼠扭体的影响 取小鼠40只,雌雄各半,体质量(20±2)g,随机分为模型对照组、松生等乙醇提取物组、松生等正丁醇提取物组和松生等乙酸乙酯提取物组,每组10只。模型对照组每天给予0.9%氯化钠溶液0.02 mL·g-1。其余各组每天分别给予等量松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物,连续灌胃3 d。末次给药30 min后,每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.02 mL·g-1,观察10 min内扭体次数及扭体潜伏期,进行组间t检验[4]。见表8。

结果表明:松生等3种提取物与模型对照组比较,均差异有统计学意义,说明三者均有一定镇痛作用。其中正丁醇提取物组和乙酸乙酯提取物组镇痛效果略高于乙醇提取物组。

2.4.3 松生等不同提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响 取小鼠40只,雌雄各半,体质量(20±2)g,随机分为模型对照组、松生等乙醇提取物组、松生等正丁醇提取物组和松生等乙酸乙酯提取物组,每组10只。每组动物实验前灌胃给药,模型对照组给予0.9%氯化钠溶液,0.02 mL·g-1,其余各组分别给予等量松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物,连续给药5 d。末次给药1 h后,每只小鼠右耳内外侧涂二甲苯50 μL致炎,左耳不涂为正常耳对照,30 min后脱颈处死,沿耳廓基线剪下双耳,用耳肿打孔器冲下左耳及右耳同一部位的圆片,立即在分析天平上称质量,以两耳片质量差作为肿胀度,进行组间差异性比较,计算耳廓肿胀率和肿胀抑制率。肿胀度(%)=(右耳质量-左耳质量)/左耳质量×100%[5];肿胀抑制率(%) =(模型对照组耳肿胀率-给药组耳肿胀率)/模型对照组耳肿胀率×100%[5-6]。结果见表9。

实验表明,松生等3种提取物给药后均可以降低二甲苯致小鼠耳肿胀,与模型对照组比较,均差异有统计学意义,而组间差异无统计学意义,说明三者均有一定抗炎作用。其中乙醇提取物组抗炎效果略高于正丁醇提取物组和乙酸乙酯提取物组。

表8 4组小鼠镇痛作用实验结果Tab.8 Results of analgesia experiment on four groups of mice ±s

表8 4组小鼠镇痛作用实验结果Tab.8 Results of analgesia experiment on four groups of mice ±s

与模型对照组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

组别小鼠/只剂量/(g·kg-1)潜伏期/min10 min内扭体/次镇痛抑制率/%模型对照组10…7.62±2.0930.14±8.61…松生等乙酸乙酯提取物组105.854.79±1.35*111.21±7.52*263.49乙醇提取物组105.855.93±2.40*122.52±10.23*125.99正丁醇提取物组105.853.07±0.17*29.72±5.31*268.10

表9 松生等不同提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响Tab.9 Effect of different extracts of Euphorbia prolifera on ear edema induced by xylene in mice ±s

表9 松生等不同提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响Tab.9 Effect of different extracts of Euphorbia prolifera on ear edema induced by xylene in mice ±s

与模型对照组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

组别小鼠/只剂量/ (g·kg-1)肿胀度/ mg肿胀抑制率/%模型对照组10…5.88±0.61…乙酸乙酯提取物组105.853.33±2.02*143.41乙醇提取物组105.852.62±1.12*255.44正丁醇提取物组105.853.70±1.04*237.12

3 讨论

本研究采用乙醇回流提取法提取松生等总黄酮[7-9],通过单因素实验考察了液料比、提取时间、乙醇浓度、提取次数对总黄酮提取率的影响,确定了正交实验的4个水平。通过正交实验及结果分析,可以得出各因素对松生等黄酮类化合物提取影响大小顺序为提取时间>料液比>提取次数>乙醇浓度。最终确定的最佳提取工艺为A2B2C1D2。即加入60%乙醇溶液,料液比1∶40,回流提取2次,提取时间3 h最合适。采用本正交实验优选的最佳工艺条件进行验证,其提取率可达5.63%,表明该工艺重现性好,提取率高。

本实验采用醋酸致小鼠扭体模型来观察松生等黄酮提取物的镇痛效果,其中松生等正丁醇提取物的疼痛控制率最高。松生等的主要有效成分为黄酮类化合物,对松生等黄酮类化合物的镇痛作用笔者尚未见文献报道。本研究在醋酸致小鼠扭体反应模型上,证明松生等黄酮提取物具有一定的镇痛效果,这为临床上使用松生等治疗炎症性疾病,缓解疼痛症状提供了实验依据。但松生等提取物的镇痛作用机制有待进一步研究。

炎症是机体对组织损伤或致病因子侵入所产生的以防御为主的反应。作用在于杀灭微生物、清除异物和自身伤亡细胞或组织,以防止损伤扩大并促进受损组织修复[10]。本实验通过观察典型的二甲苯致炎小鼠耳廓肿胀模型证明了松生等提取物的抗炎作用。结果表明,松生等提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.003

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Analgesia and Anti-inflammatory Effect of Total Flavonoids Extracted from Euphorbia prolifera

JIN Yan1,HUANG Shan1,ZHAO Lei2,PEI Xiao-na1
(1.Department of Pharmacy,Chemical EngineeringInstitute,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China;2.Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province,Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China)

ObjectiveThe study aimed to investigate the best extraction process and the analgesia and antiinflammatory properties of total flavonoids fromEuphorbia prolifera.MethodsThrough single factor experiment and orthogonal test,factors that affect the extraction yield of total flavonoids were studied,including the extraction time,solid to liquid ratio, ethanol concentration and extraction times.The mice models of ear edema induced by xylene and twisting induced by acetic acid were used to evaluate the analgesia and anti-inflammatory effects of different extractions fromEuphorbia prolifera.ResultsTotal flavonoids were extracted by the refluxing method,and the optimum conditions were extracting for 3 hours,solid to liquid ratio of 1∶30,ethanol content of 60%in the solvent,and processed for 2 times.The highest extraction yield of total flavonoids fromEuphorbia proliferawas 5.63%.The ethanol,ethyl acetate and n-butanol extracts decreased twisting and ear swelling in mice.ConclusionThe extraction for total flavonoids fromEuphorbia proliferais simple,efficient and reproducible.The ethanol,ethyl acetate and n-butanol extracts of total flavonoids have obvious analgesia and anti-inflammatory effects.

Euphorbia prolifera;Total flavonoids;Reflux extraction;Analgesia;Anti-inflammation

R286;R965

A

1004-0781(2014)11-1411-05

2013-09-06

2013-10-25

*国家自然科学基金资助项目(81360686);甘肃省教育厅硕士生导师项目(1106-02)

金岩(1978-),女,山东青岛人,讲师,博士,从事天然药物修饰及药理活性研究。E-mail:qaz309@126.com。

赵磊(1967-),女,甘肃定西人,教授,博士,从事中药化学研究。E-mail:luckleizhao@126.com。