小钻提取物抗炎镇痛活性研究*

莫单丹，唐炳兰，周小雷，王硕，刘振杰，谷筱玉，袁经权

(广西药用植物研究所天然药物化学组分研究室，南宁 530023)

小钻提取物抗炎镇痛活性研究*

莫单丹，唐炳兰，周小雷，王硕，刘振杰，谷筱玉，袁经权

(广西药用植物研究所天然药物化学组分研究室，南宁 530023)

目的 筛选小钻抗炎镇痛活性部位,为小钻的开发利用提供实验依据。方法萃取法制备不同极性小钻提取物(石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物)。将小鼠分为正常组、阳性对照阿司匹林组(50 mg·kg-1)或洛芬待因组(含可待因6.76 mg·kg-1)和小钻石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物组(500 mg·kg-1),均灌胃给药7 d。通过二甲苯致小鼠耳肿胀、小鼠棉球肉芽肿的体内实验及各萃取物调节脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌一氧化氮(NO)水平的体外实验筛选抗炎活性部位,通过小鼠热板法、醋酸扭体法筛选镇痛活性部位。结果小钻乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均能显著抑制二甲苯所致的小鼠急性耳廓肿和小鼠棉球肉芽肿(P＜0.05,P＜0.01),且均能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放(P＜0.01),具备一定抗炎活性;小钻乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均能显著减少冰醋酸所致小鼠扭体次数,提高热板致痛鼠的痛阈(P＜0.05,P＜0.01),具有一定的镇痛作用。结论小钻乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均具有抗炎镇痛活性。

小钻提取物；抗炎；镇痛

小钻(瑶语:fiuv nzunx)为瑶药经典“老班药”中“十八钻”之一,别名小怎美(fiuv zing hmei)、铜精端、小钻骨风、南五味子、红木香、紫金皮、内风消、大活血,来源于五味子科南五味子属植物长梗南五味子Kasdsura longipedunculataFinet et Gagnep的根和茎。主要分布于我国南部,如云南、四川、浙江、福建、广东、广西等省。小钻味甘、苦、辛,性温,属风打相兼药。能健脾补肾,理气活血,祛风通络,消肿止痛。小钻为广西瑶医习用药材,用于治疗产后水肿、经闭腹痛、疝气痛、肾虚腰痛、胃痛、头风痛、风湿性关节炎、跌打损伤和骨折等[1]。目前未见关于小钻抗炎镇痛活性方面的报道。笔者在本实验中对小钻的抗炎镇痛活性进行研究,以期为进一步开发利用小钻提供依据。

1 材料与方法

1.1 试药 小钻药材采自广西壮族自治区金秀瑶族自治县,经广西中医药大学刘寿养教授鉴定为五味子科南五味子属植物长梗南五味子(Kasdsura longipedunculataFinet et Gagnep)。取其干燥根和茎打成粗粉,用80%乙醇浸泡提取2次,每次7 d。回收乙醇,提取浸膏溶于适量水,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,并减压浓缩得石油醚提取物(A)、乙酸乙酯提取物(B)、正丁醇提取物(C)和水提取物(D)。各组分均用0.5%羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)溶液超声溶解,分别配成50 mg·mL-1溶液,备用;阿司匹林肠溶片(拜耳医药保健有限公司,批号:BJ07490,使用时以纯化水配成5 mg·mL-1);洛芬待因缓释片(西南药业股份有限公司,批号:121105);二甲苯(分析纯,上海试剂一厂,批号:试-2005-06-12);冰醋酸(分析纯,成都市科龙化工试剂厂,批号:20100111);改良Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle's Medium,DMEM)高糖培养基(北京Hyclone);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);一氧化氮试剂盒(碧云天生物技术研究所);脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),美国Sigma公司);四甲基偶氮唑蓝(mmethyl thiazolyl tetrazolium,MTT,美国Sigma公司)。

1.2 动物 昆明种小鼠(SPF级),体质量(20±2)g,由广西医科大学实验动物中心提供,实验动物许可证号:SCXK(桂)2012-0003。

1.3 细胞 RAW264.7小鼠巨噬细胞(购自中国科学院细胞库)。

1.4 仪器 EYELA N-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司),HX-T电子天平(慈溪市天东衡器厂),电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司),YLSQ4耳冲打孔器(淮北正华生物仪器设备有限公司), YLS-6B智能热板仪(北京安得尔科技有限公司), DMI4000B倒置显微镜(德国Leica),BC-J80S50CO2培养箱(上海博讯),YXQ-LS-100SII高压灭菌器(上海博讯),Infinite®F200 pro多功能酶标仪(瑞士Tecan)。

1.5 抗炎作用实验

1.5.1 小鼠急性耳廓肿 取小鼠60只,雌雄各半,随机分为6组,每组10只。即正常组(纯化水),阳性对照组(阿司匹林50 mg·kg-1),小钻石油醚组(A),小钻乙酸乙酯组(B),小钻正丁醇组(C),小钻水提物组(D) (均含生药量500 mg·kg-1),灌胃给药,qd,连续给药7 d,末次给药后1 h,二甲苯0.1 mL均匀涂布于各鼠右耳正反面,左耳不处理,30 min后将小鼠处死,用8 mm打孔器在两耳同一部位扎下左右耳片,精密称质量,以右耳质量减去左耳质量,作为耳廓炎性肿胀度,计算右耳肿胀度及抑制率[2]。抑制率(%)=(空白组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白组平均肿胀度×100%。

1.5.2 棉球肉芽肿 取雄性小鼠60只,乙醚浅麻醉下腹部切口,将一个已高压灭菌的棉球10 mg植入小鼠右侧腋窝皮下。分组及给药方法同“1.5.1”,连续7 d,末次给药后1 h处死小鼠,剥离肉芽肿棉球,剔除脂肪组织,在70℃烘箱中干燥2 h后称质量,减去原棉球质量即为肉芽肿质量[3],并计算抑制率。抑制率(%)=(空白组平均肉芽肿质量-给药组平均肉芽肿质量)/空白组平均肉芽肿质量×100%。

1.5.3 细胞的培养 RAW264.7细胞在37℃、5%二氧化碳(CO2)条件下,用含10%胎牛血清、青霉素(100 U·mL-1)及链霉素(50 μg·mL-1)的DMEM高糖培养基培养,待细胞生长至对数期。

1.5.4 小钻提取物对RAW264.7细胞活力的影响取处于对数生长期的RAW264.7细胞,胰酶消化,调整细胞悬液浓度为105个·mL-1,接种于96孔培养板中(每孔100 μL),培养24 h后,给药,空白组加10%血清DMEM培养液,继续放入培养箱培养24 h,取出培养板,各孔加入5 mg·mL-1MTT20 μL,放入培养箱中孵育4 h,弃去上清液,每孔加二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μL,把96孔培养板置于酶标仪中震荡10 min,波长492 nm处测量各孔吸光度(A)值,计算细胞相对抑制率[4]。细胞相对抑制率(%)= (1-实验组A均值/对照组A均值)×100%。

1.5.5 小钻提取物对RAW264.7细胞LPS刺激模型NO释放的影响 将细胞培养至对数生长期,用0.25%胰蛋白酶消化105个·mL-1,接种于96孔培养板(每孔100 μL),培养24 h后,加入含小钻萃取物的DMEM培养基(终浓度分别为50,100,200 μg·mL-1,每个剂量组复孔为8个),并加入LPS(终浓度1 μg·mL-1),同时设定空白组(加培养基)、模型组(加培养基和LPS)继续孵育24 h,收集细胞培养上清液,按试剂盒说明书测定NO。

1.6 镇痛作用

1.6.1 醋酸扭体法 取小鼠60只,雌雄各半,分组及给药方法同“1.5”项,连续7 d,末次给药后1 h腹腔注射0.7%醋酸溶液,每只0.4 mL。观察并记录注射醋酸溶液15 min内出现扭体反应的次数,计算药物镇痛百分率[5]。镇痛百分率(%)=(空白组扭体次数-给药组扭体次数)/空白组扭体次数×100%。

1.6.2 热板法 选出对55℃热板痛觉反应在10～30 s的雄性小鼠60只,随机分为6组,每组10只。阳性组给予洛芬待因缓释片(含磷酸可待因6.76 mg·kg-1),空白对照组给予同体积纯化水,灌胃给药,连续7 d,按0.5 g·kg-1剂量给药,每只小鼠给药前及末次给药后30,60,90,120 min测定痛反应潜伏期,计算痛阈提高率[4]。

1.7 统计学方法 应用SPSS 17.0版统计软件进行统计学处理,实验数据用均数±标准差(±s)表示。各组间比较采用t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠耳廓肿胀的影响 从表1可知,B、C、D组二甲苯所致小鼠急性耳廓肿胀均被显著抑制,其中C组抑制率55.83%,与纯化水组比较,差异有统计学意义(P＜0.01),B组和D组与纯化水组比较,均差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 6组小鼠耳廓肿胀实验结果Tab.1 Results of auricle swelling test in six groups of mice ±s

表1 6组小鼠耳廓肿胀实验结果Tab.1 Results of auricle swelling test in six groups of mice ±s

与纯化水组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with purified water group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

组别小鼠/只剂量/(mg·kg-1)耳廓肿胀度/mg耳肿胀抑制率/%纯化水组1009.08±4.020.00阿司匹林组10503.40±0.98*162.55 A组105008.57±1.665.61 B组105005.41±1.21*240.41 C组105004.01±1.20*155.83 D组105005.45±1.43*239.97

2.2 对小鼠棉球肉芽肿的影响 见表2。B、C、D组小鼠棉球肉芽肿均被抑制,与纯化水组比较,均差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 6组小鼠棉球肉芽肿实验结果Tab.2 Results of granuloma test induced by cotton ball in six groups of mice ±s

表2 6组小鼠棉球肉芽肿实验结果Tab.2 Results of granuloma test induced by cotton ball in six groups of mice ±s

与纯化水组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with purified water group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

组别小鼠/只剂量/(mg·kg-1)肉芽肿干重/mg抑制率/%纯化水组10028.48±3.430.00阿司匹林组105021.21±3.14*125.53 A组1050025.74±3.189.58 B组1050022.44±3.88*221.21 C组1050024.12±3.44*215.31 D组1050023.02±3.83*219.17

2.3 小钻提取物对RAW264.7细胞LPS刺激模型NO释放的影响 见表3。石油醚提取物对细胞有很大毒性,故未继续进行“1.5.5”项实验。从表3可知,乙酸乙酯、正丁醇、水提取物均能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放,显示出一定的抗炎活性。

2.4 对小鼠醋酸性扭体反应的抑制作用 见表4,B、C、D组提取物均有镇痛作用,能减少冰醋酸所致的小鼠扭体次数,其中C组15 min内扭体次数与纯化水组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),B组和D组15 min内扭体次数与纯化水组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。

表3 5组RAW264.7细胞NO浓度测定结果Tab.3 Results of NO concentration in five group of RAW264.7 cells n=8,±s

表3 5组RAW264.7细胞NO浓度测定结果Tab.3 Results of NO concentration in five group of RAW264.7 cells n=8,±s

与模型组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

组别剂量/(μg·mL-1) NO浓度/(μmol·L-1)空白组07.82±0.30*1模型组09.36±0.29 B组2006.23±0.49*11006.17±0.80*1505.60±0.79*1C组2007.20±0.61*11006.94±0.66*1506.61±0.54*1D组2006.82±0.64*11007.01±0.88*1508.99±0.81

表4 6组小鼠扭体反应实验结果Tab.4 Results of writhing test in six groups of mice ±s

表4 6组小鼠扭体反应实验结果Tab.4 Results of writhing test in six groups of mice ±s

与纯化水组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with purified water group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

组别小鼠/只剂量/(mg·kg-1) 15 min内扭体次数/次镇痛率/%纯化水组10033.3±5.30.00阿司匹林组105014.6±4.356.16 A组1050032.7±6.41.80 B组1050020.3±7.3*139.04 C组1050022.9±9.2*231.23 D组1050017.6±6.2*147.15

2.5 小鼠热板法镇痛作用 由表5可见,B组和C组热板致痛鼠的痛阈值与给药前相比,均显著提高,B组小鼠给药后90和120 min及C组小鼠给药后120 min与给药前比较,差异有统计学意义(P＜0.01),C组小鼠给药60,90 min痛阈值与给药前比较,差异有统计学意义(P＜0.05);相同时间B组小鼠给药60 min和D组小鼠给药后90和120 min痛阈值比纯化水组显著提高,差异有统计学意义(P＜0.05),相同时间B组小鼠给药后90,120 min和C组小鼠给药后60,90及120 min痛阈值比纯化水组显著提高,差异有统计学意义(P＜0.01)。

表5 6组小鼠热板致痛反应实验结果Tab.5 Results of hot plate-induced pain test in six groups of mice ±s,n=10

表5 6组小鼠热板致痛反应实验结果Tab.5 Results of hot plate-induced pain test in six groups of mice ±s,n=10

相同时间与纯化水组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01;与本组给药前比较,*3P＜0.01,*4P＜0.05Compared with purified water group at the same time,*1P＜0.05,*2P＜0.01;Compared with the same group before dosing,*3P＜0.01,*4P＜0.05

组别剂量/(mg·kg-1)给药前痛阈值/s给药后痛阈值/s 30 min60 min90 min120 min痛阈提高百分率/% 30 min60 min90 min120 min纯化水017.4±5.614.0±5.515.1±3.113.5±7.216.8±8.40.00.00.00.0洛芬待因5020.0±7.815.3±5.122.3±6.5*135.8±9.8*2*328.0±7.9*10.011.579.040.0 A组50018.4±4.819.6±5.119.8±4.418.2±6.221.2±5.36.57.60.015.2 B组50020.6±8.014.4±5.026.0±11.4*136.0±9.0*2*339.8±12.8*2*30.026.274.893.2 C组50019.8±7.315.5±6.332.0±10.9*2*436.3±15.4*2*442.0±11.9*2*30.061.683.3112.1 D组50018.9±8.512.0±4.121.1±7.322.9±8.1*128.9±9.7*10.011.621.152.9

3 讨论

笔者在本实验中采用二甲苯致小鼠耳肿胀、小鼠棉球肉芽肿等体内实验及各萃取物调节LPS诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌NO水平的体外实验筛选抗炎活性部位。通过小鼠热板法、醋酸扭体评价和比较了瑶药小钻不同溶剂提取物的抗炎镇痛效果。小钻乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均具有抗炎活性,能减少二甲苯致小鼠急性耳廓肿以及小鼠棉球肉芽肿的肿胀程度;小钻乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物还具有明显的镇痛活性,能提高热板致痛小鼠的痛阈,延缓热板疼痛反应时间,减少冰醋酸刺激致痛小鼠扭体次数。实验证明,小钻乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均具有抗炎镇痛活性。本研究为瑶药小钻的综合开发利用和扩大药源提供了科学的实验依据。

[1] 戴斌.中国现代瑶药学[M].南宁:广西科学技术出版社, 2009:70-72.

[2] 唐炳兰,陈路,李茂,等.五淋散胶囊药效学研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(8):179-182.

[3] 陈建双,张玉玲,赵波,等.赤雹根总皂苷抗炎作用研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(8):163-165.

[4] 蔡茁,俞发.木瓜提取物体内、体外抗炎镇痛作用的实验研究[J].中国中医药咨讯,2009,1(5):1-3.

[5] 唐炳兰,缪剑华,程燕,等.壮瑶五验方抗病毒、抗菌、解热、镇痛、消炎作用研究[J].广西医科大学学报,2008, 25(3):378-381.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.005

Anti-inflammation and Analgesic Effects of the Extracts from Kasdsura Longipedunculata Finet et Gagnep

MO Dan-dan,TANG Bing-lan,ZHOU Xiao-lei,WANG Shuo,LIU Zhen-jie,GU Xiao-yu,YUAN Jing-quan
(Natural Medicine Research Laboratory of Chemical Composition Institute of Guangχi Medicinal Plant,Nanning 530023,China)

Objective To screen the anti-inflammatory and analgesic extracts fromKasdsura longipedunctulata Finet et Gagnepand provide theoretic basis for its further exploitation and utilization.MethodsDifferent extracts(petroleum ether extract,ethyl acetate extract,n-butyl alcohol extract,water extract)were prepared.Mice were randomly divided into normal control,positive control with aspirin(50 mg·kg-1)or ibuprofen codeine(containing codeine 6.76 mg·kg-1),and petroleum ether,ethyl acetate,butanol,water extract groups(at 500 mg·kg-1each).Extracts or controls were intragastrically administered once daily for 7 consecutive days.The anti-inflammatory part fromKasdsura longipedunctulata Finet et Gagnepwas screened through xylene-induced ear edema,granuloma grew in mice,and nitric oxide(NO)level detection in macrophage RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide(LPS).The analgesic action of the extracts were tested with the hot plate method and acetic acid writhing in mice.ResultsAll of ethyl acetate extracts,n-butanol extracts and water extracts significantly inhibited the mice auricle swelling caused by xylene and cotton ball granuloma in mice(P＜0.05 orP＜0.01),and obviously reduced the NO release from LPS induced RAW264.7 cells(P＜0.01),which manifesting certain anti-inflammatory activity.The three extracts significantly decreased acetic acid-induced writhing,and attenuated hot plate induced pain by raising the pain threshold in mice (P＜0.05 orP＜0.01).ConclusionAll of the ethyl acetate extract,n-butanol extract,and water extract fromKasdsura longipedunctulata Finet et Gagnepexert anti-inflammatory and analgesic activity.

Bradawl;Anti-inflammation;Analgesia

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0291-04

2013-07-19

2013-08-20

*国家科技支撑计划项目(2012BAI27B06);瑶药创新体系建立及广西民族医药产业化技术平台建设(桂科能10100027-3);广西生物医药创业服务平台建设(桂科能10100024-4);广西中医药管理局项目(GZZY13-35)

莫单丹(1980-),女,广西那坡人,研究实习员,学士,研究方向:中药药理。电话:0771-2443036,E-mail：modan991220@163.com。

袁经权(1967-),男,广西玉林人,副研究员,博士,研究方向:中药新产品研发。电话:0771-5602461,E-mail：yjqgx@163.com。