奎宁和甘珀酸对豚鼠肠系膜动脉平滑肌细胞间缝隙连接通道的影响*

张治平，司军强，李新芝，李丽，魏丽丽，马克涛

(石河子大学医学院 1.生理学教研室;2.病理生理学教研室，石河子 832000)

·药物研究·

奎宁和甘珀酸对豚鼠肠系膜动脉平滑肌细胞间缝隙连接通道的影响*

张治平1，司军强1，李新芝2，李丽1，魏丽丽1，马克涛1

(石河子大学医学院 1.生理学教研室;2.病理生理学教研室，石河子 832000)

目的 观察奎宁和甘珀酸对肠系膜动脉平滑肌细胞间缝隙连接通道的影响,为探索强效缝隙连接阻断药提供实验依据。方法采用全细胞膜片钳技术探讨奎宁和甘珀酸对豚鼠肠系膜动脉段上平滑肌细胞膜电容、细胞膜电导或细胞膜电阻的影响。结果肠系膜动脉段上平滑肌细胞膜电容和细胞膜电导大约是消化的单个细胞的10倍,提示细胞间存在丰富的缝隙连接通道。奎宁和甘珀酸能够浓度依赖地减少肠系膜动脉段上平滑肌细胞膜电容和膜电导,抑制细胞膜电导的半数抑制浓度分别为1.56和0.13 mmol·L-1,当奎宁≥3 mmol·L-1或者甘珀酸≥0.3 mmol·L-1时,肠系膜动脉段上平滑肌细胞的膜电容、膜电导或膜电阻与单个细胞的数值十分接近。提示奎宁和甘珀酸能够完全阻断细胞间缝隙连接通讯。结论奎宁和甘珀酸能够浓度依赖地阻断肠系膜动脉细胞间缝隙连接通道,甘珀酸的抑制效力更强。

奎宁；甘珀酸；肠系膜动脉；缝隙连接；膜片钳

缝隙连接广泛存在于多种组织和器官,是细胞间电化学信息传递直接通路[1-2]。缝隙连接的基本构成单位是连接子,由6个不同或相同的连接蛋白(connexin,Cx)亚单位环绕,形成一个中心约1.5 nm的孔道,相邻细胞膜上的两个连接子对接便形成一个缝隙连接通道。缝隙连接可以允许相对分子质量＜1 000的分子通过。目前发现超过20种连接蛋白表达在不同的组织和器官[1,3],其中在血管微动脉主要表达Cx37、Cx40、Cx43和Cx45[4]。缝隙连接在维持生理功能中发挥着重要作用,尤其在血管舒缩运动的调节中更为突出[4-8]。血管平滑肌细胞和内皮细胞同步化以及血管舒缩信号在内皮细胞和平滑肌细胞之间传递都依赖细胞间缝隙连接的完整性[5,9]。为了研究缝隙连接在生理和病理生理状态下所扮演的角色,需要有特异性缝隙连接阻断药。前期研究发现,奎宁和甘珀酸分别可以阻断培养的神经瘤母细胞和人突变成纤维细胞间的缝隙连接[10-12],但在急性分离的血管微动脉标本上尚无类似研究。本实验在豚鼠急性分离的肠系膜动脉(mesenteric artery,MA)上应用全细胞膜片钳技术,观察奎宁和甘珀酸对血管微动脉平滑肌细胞间缝隙连接的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验豚鼠,雌雄不拘,新疆维吾尔自治区疾病控制中心动物饲养科提供,动物质量符合一级标准,体质量200～300 g,麻醉状况下处死后取出肠系膜并置于生理盐溶液中。生理盐溶液包括:氯化钠(NaCl) 138 mmol·L-1,氯化钾(KCl)5 mmol·L-1,氯化钙(CaCl2)1.6 mmol·L-1,氯化镁(MgCl2)1.2 mmol·L-1, 4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyerthyl)piperazine-1-erhaesulfonic acid,Na-HEPES]5 mmol·L-1,N-(2-羟乙基哌嗪-N′-(Z-乙磺酸)钠盐[N-2(hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonicacid,sodiumsalt,HEPES] 6 mmol·L-1,葡萄糖7.5 mmol·L-1。在生理盐溶液中,迅速取出肠系膜动脉及其分支。

动脉段标本的制备:动脉段标本直径约100 μm,长约0.4 mm,两端用细铂金片固定在培养皿底部,在37℃温箱中用含1.5 mg·mL-1胶原酶A的生理盐溶液消化15 min,然后用不含胶原酶的生理盐溶液置换2次,体显微镊下去除结缔组织后进行微动脉段全细胞膜片钳。

单个平滑肌细胞的制备:微动脉置于细胞分离液中20 min,细胞分离液包括:NaCl 142 mmol·L-1,KCl 5mmol·L-1,CaCl20.05mmol·L-1,MgCl21 mmol·L-1,Na-HEPES4mmol·L-1,HEPES 5 mmol·L-1,葡萄糖7.5 mmol·L-1。将微动脉剪成几段放入消化液后,在37℃温箱中消化20～25 min,消化液包括:木瓜蛋白酶0.75 mg·mL-1,胶原酶IA 1 mg·mL-1,二硫苏糖醇0.3 mg·mL-1,牛血清清蛋白3.75 mg·mL-1。1 000 r·min-1离心6 min后弃上清液,加入细胞分离液制成细胞悬浮液,反复替换3次后将液体移至用多聚赖氨酸处理过的培养皿内,静置30 min使细胞贴壁后进行全细胞膜片钳实验。

1.2 全细胞膜片钳记录 室温下进行全细胞膜片钳实验。记录电极阻抗约为5 MΩ,由P-97拉制仪拉制。电极内液包括:K-gluconate 130mmol·L-1,NaCl 10 mmol·L-1,CaCl22.0mmol·L-1,MgCl21.2 mmol·L-1,HEPES 10 mmol·L-1,乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸[Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraaceticacid,EGTA]5 mmol·L-1,葡萄糖7.5 mmol·L-1。通过微操纵器触及到细胞膜后给予负压形成GΩ封接。补偿电极电容后给予瞬时电刺激或者负压击破细胞膜,形成全细胞膜片钳,膜电流用10 kHz低频滤过[13]。

1.3 实验药物 实验药物用生理盐溶液配制,通过开关控制药物灌流标本,保持灌流速度、温度和其他成分不变。奎宁和甘珀酸由Sigma公司提供,其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0版统计软件进行统计学处理,以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉段上平滑肌细胞间存在缝隙连接 肠系膜动脉段和单个平滑肌细胞的膜电容、膜电导和膜电阻见表1。动脉段标本上平滑肌细胞膜电容和膜电导大约是消化分离的单个平滑肌细胞的10倍,提示微动脉段标本上平滑肌细胞间存在着缝隙连接通道。

表1 微动脉段上和单个平滑肌细胞的膜电生理特性比较Tab.1 Comparison of character of membrane electrophysiology between arteriole and the dispersed smooth muscle cell ±s

表1 微动脉段上和单个平滑肌细胞的膜电生理特性比较Tab.1 Comparison of character of membrane electrophysiology between arteriole and the dispersed smooth muscle cell ±s

与动脉段标本比较,*1P＜0.01Compared with arteriole samples,*1P＜0.01

膜电生理特性例数膜电阻/MΩ膜电导/nS膜电容/pF动脉段标本12 380±613.17±0.44149.00±23.00单个平滑肌细胞16 2 759±293*10.48±0.045*113.20±0.98*1

2.2 奎宁和甘珀酸抑制动脉段上平滑肌细胞间的缝隙连接 图1显示,0.3 mmol·L-1甘珀酸和3 mmol·L-1奎宁都能够显著抑制微动脉段上平滑肌细胞的膜电导和膜电容。甘珀酸使细胞膜电导分别从2.43 nS降至0.20 nS,膜电容从97 pF降至12.6 pF;奎宁使细胞膜电导分别从4.68 nS降至0.45 nS,膜电容从132 pF降至14.3 pF。应用单指数方程分别对施加奎宁和甘珀酸前后拟合发现,未应用奎宁和甘珀酸前拟合效果较差(r≤0.90),应用奎宁和甘珀酸后拟合效果很好(r＞0.98),且细胞膜充放电的时间常数也显著降低。表2总结了应用甘珀酸和奎宁对细胞膜电容、膜电阻和膜电导的影响,结果显示应用0.3 mmol·L-1甘珀酸和3 mmol·L-1奎宁后上述电生理参数与表1中单个平滑肌细胞的数值十分接近,提示甘珀酸和奎宁可以完全阻断细胞间的缝隙连接。

此外,给予Ramp电压刺激发现奎宁和甘珀酸净电流I/V曲线为线性,且净电流翻转电位与细胞静息电位十分接近(图2)。提示奎宁和甘珀酸主要抑制细胞间的缝隙连接,减少细胞的膜电导。

图1 甘珀酸(A)和奎宁(B)对微动脉平滑肌细胞间缝隙连接的抑制作用Fig.1 Inhibition of carbenoxolone(A)and quinine(B)on gap junction channel of arterial smooth muscle cells

表2 奎宁和甘珀酸对动脉段上平滑肌细胞膜电生理特性的影响Tab.2 Effect of quinine and carbenoxolone on electrophysiological characteristics of arterial smooth muscle cells ±s

表2 奎宁和甘珀酸对动脉段上平滑肌细胞膜电生理特性的影响Tab.2 Effect of quinine and carbenoxolone on electrophysiological characteristics of arterial smooth muscle cells ±s

与奎宁对照组比较,*1P＜0.01Compared with quinine control group,*1P＜0.01

药物与分组例数膜电阻/MΩ膜电导/nS膜电容/pF奎宁对照组6452.00±90.002.79±0.62120.00±11.00处理组62 322.00±551.00*10.58±0.17*115.80±0.69*1甘珀酸对照组6383.00±52.003.74±0.55179.00±44.00处理组62 062.00±622.00*10.60±0.19*117.30±0.93

2.3 奎宁和甘珀酸浓度依赖抑制肠系膜动脉平滑肌细胞间缝隙连接通道 奎宁和甘珀酸对微动脉平滑肌细胞间缝隙连接通道的抑制具有浓度依赖性(图3), 0.01～3 mmol·L-1奎宁和甘珀酸可以浓度依赖地降低肠系膜动脉段上平滑肌细胞膜电导。奎宁和甘珀酸抑制肠系膜动脉微动脉段上平滑肌细胞膜电导的半数抑制浓度分别是1.56和0.13 mmol·L-1。甘珀酸对微动脉细胞间缝隙连接的抑制效力更强。

3 讨论

笔者在本实验中发现,奎宁和甘珀酸能够浓度依赖地抑制豚鼠肠系膜动脉段上平滑肌细胞间缝隙连接通道。此结果由以下两点证实:①奎宁和甘珀酸能够使微动脉段上平滑肌细胞膜电导和膜电容减少至单个细胞水平;②由Step电压刺激引起的细胞膜充放电由单指数方程去拟合效果较差,提示更多的细胞通过缝隙连接通道参与了记录平滑肌细胞膜的充放电过程,而给予奎宁和甘珀酸后记录细胞与相邻细胞间的缝隙连接通讯被阻断后单指数方程则拟合很好[14-15]。

图2 甘珀酸(A)和奎宁(B)净电流I/V曲线a,c为未使用甘珀酸和奎宁下平滑肌细胞的I/V曲线;b,d为应用甘珀酸和奎宁后平滑肌细胞的I/V曲线Fig.2 Carbenoxolone(A)and quinine(B)-induced net current I/V curvesa,c.the I/V curves of smooth muscle cells in the absence of carbenoxolone and quinine;b,d.the I/V curves of smooth muscle cells in the presence of carbenoxolone and quinine

图3 甘珀酸(A)和奎宁(B)浓度依赖的抑制肠系膜动脉段上平滑肌细胞膜电导

前期有报道称在培养的神经瘤母细胞上奎宁能够选择性和可逆的阻断分别由Cx36和Cx50构成的缝隙连接通道,半数抑制浓度分别为32和73 μmol·L-1。高浓度的奎宁(300 μmol·L-1)亦可阻断表达Cx45的神经瘤母细胞间缝隙连接通讯。但是对由Cx26、Cx32、Cx40或Cx43组成的缝隙连接通道没有影响[10-11]。在人突变成纤维细胞系上甘珀酸能够阻断细胞间缝隙连接[12]。本研究发现奎宁和甘珀酸能够浓度依赖和可逆的阻断肠系膜动脉细胞间缝隙连接通讯,进一步验证了以上结果。此外,前期的研究结果主要在培养的细胞上进行,所得实验结果并不能一定适用于在体标本,并且由于不同部位表达连接蛋白的种类和功能存在差异,因此前期所获结果并不能适用于血管标本。血管微动脉表达Cx37、Cx40、Cx43和Cx45等4种连接蛋白,其中内皮细胞主要表达Cx37、Cx40和Cx43,平滑肌细胞上主要表达Cx37、Cx43和Cx45[4]。结合本实验结果,笔者推测在肠系膜动脉平滑肌细胞间主要表达由Cx45构成的缝隙连接,传递细胞间的电化学信息,保证血管舒缩同步。

缝隙连接是细胞间进行直接物质交换和信息通讯的唯一途径,能够允许Na+、K+、Ca2+、H+以及相对分子质量＜1 000的分子(cAMP、Ca2+、IP3)[16]等自由通过。缝隙连接参与了多种正常生理功能,如个体发育、形态发生、细胞增殖/分化/凋亡、细胞周期和信号转导等。缝隙连接也与血管紧张度的调节密切相关[5],通过缝隙连接电化学信号的直接交流,使血管能够保持电和机械活动的同步性,对刺激信息作出统一的反应,保证血管功能的稳定和一致。病理情况下,伤害性信息也可通过缝隙连接传递至正常细胞引起病理性改变[5],缝隙连接阻断药能够阻止其发生。SALTMAN等[17]报道应用缝隙连接阻断药庚醇通过阻断心肌细胞间的缝隙连接通讯,能够显著减少梗死面积。因此,缝隙连接阻断药在治疗心血管疾病中将会是非常重要的工具。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.002

Effect of Quinine and Carbenoxolone on Gap Junction of Vascular Smooth Muscle Cells in Guinea Pig

ZHANG Zhi-ping1,SI Jun-qiang1,LI Xin-zhi2,LI Li1,WEI Li-li1,MA Ke-tao1
(1.Department of Physiology; 2.Department of Pathophysiology,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

Objective To investigate the influence of quinine and carbenoxolone on gap junction channel in vascular smooth muscle cells of acutely isolated mesenteric artery(MA)segments in support of the development of gap junction inhibitors.MethodsThe whole-cell patch clamp was used to study the effect of quinine and carbenoxolone on membrane input capacitance (Cinput),membrane input conductance(Ginput)or membrane input resistance(Rinput)of vascular smooth muscle cells embedded in arteriole segments.ResultsThe Cinput and Ginput of in situ cells of MA were about 10 times of the dispersed cell.Quinine and carbenoxolone concentration-dependently and reversibly suppressed Ginput or increased Rinput,with a half maximal inhibitory concentration(IC50)of 1.56 mmol·L-1and 0.13 mmol·L-1in acutely isolated MA segments,respectively.After application of quinine(≥3 mmol·L-1)or carbenoxolone(≥0.3 mmol·L-1),the Cinput,Ginput and Rinput of the in situ cells were very close to the single dispersed cell in MA.ConclusionQuinine and carbenoxolone inhibit gap junction channel in vascular smooth muscle cells of MA in a concentration-dependent manner,in which carbenoxolone is more powerful than quinine.

Mesenteric artery;Quinine;Carbenoxolone;Gap junction;Patch clamp

R331.3;R965

A

1004-0781(2014)03-0279-05

2013-05-14

2013-06-20

*国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2012CB526600);国家自然科学基金资助项目(31100829, 31260247,81260519,81000411)

张治平(1977-),男,甘肃定西人,主治医师,硕士,研究方向:循环生理。电话:0993-2858458,E-mail：746691675@qq.com。

马克涛(1979-),男,河北唐山人,副教授,博士,研究方向:循环生理。电话:0993-2057137,E-mail：maketao@hotmail.com。