丹参酮ⅡA衍生物的合成与放射增敏活性测定*

李光强，赵洁，沈秀，周则卫，徐文清

(北京协和医学院、中国医学科学院放射医学研究所，天津市分子核医学重点实验室，天津 300192)

丹参酮ⅡA衍生物的合成与放射增敏活性测定*

李光强，赵洁，沈秀，周则卫，徐文清

(北京协和医学院、中国医学科学院放射医学研究所，天津市分子核医学重点实验室，天津 300192)

目的 对丹参酮ⅡA进行结构修饰,以期得到放射增敏效果较好的衍生物。方法通过曼尼希反应在丹参酮ⅡA的16位引入不同的小分子胺,通过EI-MS、1HNMR确证化合物结构,通过噻唑蓝(MTT)法测定其对Hela细胞的半数抑制浓度(IC50)及20%抑制浓度(IC20)值,初步评价几种衍生物的放射增敏活性。结果得到丹参酮的5个化合物,其中4个未见文献报道。其中3个进行了放射增敏活性测定,发现在16位引入芳香环的衍生物C5放射增敏效果增强。结论在16位引入芳香环可能是提高药物放射增敏活性的一种方式。

丹参酮ⅡA；结构修饰；辐射增敏

丹参具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦、养血安神的功效。现代药理研究表明,丹参具有多种生物活性,包括抗炎、抗氧化、强心、降血脂、抗微生物、抗肿瘤[1-3]等。丹参酮是丹参的主要药效成分。放射增敏作用主要针对肿瘤内放射抗拒的乏氧细胞而提出,指某些化合物能增强射线对肿瘤内乏氧细胞的杀灭作用,而对有氧的正常组织损伤小,这些化合物被称为放射增敏药。本课题组前期研究评价了几种丹参酮对Hela细胞抑制作用的构效关系[4]。笔者在本实验中拟通过曼尼希反应[5]在丹参酮ⅡA的D环上引入位阻基团和芳香基团,以期得到细胞毒性更强和放射增敏活性更高的衍生物。

1 材料与方法

1.1 试剂 丹参酮ⅡA(西安鸿生生物技术有限公司,批号:100926,纯度:95.3%),胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司,批号:20121213),1640培养基(Hyclone公司,批号:NYCO828),噻唑蓝[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide,MTT,天津华生源科技有限公司,批号:822A056],其他试剂均为市售。

1.2 细胞和细胞株 人宫颈癌细胞株Hela细胞购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

1.3 仪器 VG ZAB-HS高分辨有机磁质谱仪,Varian Mercury V×300型核磁共振仪,二氧化碳(CO2)培养箱(美国Themo公司),超净工作台(苏州精华设备公司),TECAN-infinite M200型酶标仪,铯(137Cs)放射源,剂量率:0.78 Gy·min-1。

1.4 衍生物的合成 化合物C1的合成:称取丹参酮ⅡA138 mg,溶于15 mL冰乙酸中,加入37%甲醛溶液150 μL,二环己胺252 μL,60℃反应16 h,萃取,旋干溶剂得到固体混合物,过硅胶柱石油醚/乙酸乙酯= 5∶1,旋干得到橘红色主要产物50 mg,通过核磁谱及质谱进行结构鉴定。化合物C2～C5的合成类似C1。

1.5 生物实验

1.5.1 MTT测定化合物对Hela细胞半数抑制浓度[half maximal inhibitory concentration(IC)of a substance(50% IC,or IC50)]和20%抑制率抑制浓度[20%inhibitory concentration of a substance(20%IC,or IC20)]值 取对数期Hela细胞,胰蛋白酶消化成单细胞悬液,用培养基(10%胎牛血清、90%1640培养基、青霉素、链霉素各100 U·mL-1)稀释成30 000个·mL-1。铺于96孔板上,每孔加100 μL,每孔约3 000个,培养10 h后加药[药物设置梯度5个:25,12.5,6.25,3.1,1.6 μmol·L-1,溶解介质为培养基加1%二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)] 100 μL(每个药物梯度设置复孔5个),分别培养24,48, 72 h。培养结束后每孔加MTT20 μL,继续培养4 h,吸净板孔内的培养基,每孔加DMSO 150 μL,摇床震荡10 min, 490 nm处测其吸光度(A)值。统计软件计算IC50和IC20。

1.5.2 MTT法测定衍生物的放射增敏活性 取对数期Hela细胞,胰蛋白酶消化成单细胞悬液后,用培养基(10%胎牛血清,90%1640培养基,青霉素、链霉素各100 U·mL-1)稀释至30 000个·mL-1。铺于96孔板上,每孔加100 μL,每孔约3 000个,培养10 h后加药(每个药设置复孔5个,药物浓度为IC20浓度值)设置5组,培养12 h后分别照射0,1,2,4,6 Gy。继续培养12 h,培养结束后每孔加MTT20 μL,继续培养4 h,吸净板孔内培养基,每孔加DMSO150 μL,摇床震荡10 min, 490 nm波长处测A值。单因素方差分析比较照射给药组和单纯照射组,初步评价是否具有放射增敏活性。

2 结果

2.1 化学合成结果 合成得到化合物C1 50 mg,主要产物橘红色,经查证为新化合物。EI-MS(m/z): 324.1,291.1,235.1,147.1,69.0,57.0。1H NMR (300 MHz)δ:7.61～7.58(1H,d,H-7),7.54～7.52 (1H,d,H-6),4.66(2H,s,H-17),3.18～3.14(2H,t, H-1),2.28～2.52(3H,S,H-15),1.83～1.77(3H,m, H-4),1.76～1.63(3H,m,H-4),1.33～1.27(16H,m, H-环己胺)。

化合物C2的合成,即在16位引入了一个羟甲基,经查证为新化合物。EI-MS(m/z):306.2,261.2 (100),189.1,139.1,89.0,43.0。1HNMR (300 MHz)δ:9.13～9.1(1H,d,H-1),8.41～8.38 (1H,d,H-3),7.81-7.78(1H,d,H-6),7.59～7.54 (1H,dd,H-3),7.41～7.39(1H,d,H-7),5.42(1H,s羟基-H),4.48～4.47(2H,d,H-20),2.65(3H,s,H-4),2.14(3H,s,H-18)。

化合物C3的合成方法类似C1:得到化合物C3 20 mg,产率20%。即:丹参酮ⅡA的16位引入羟甲基。EI-MS(m/z):324.1(100),235.1,165.0,128.0, 69.0,43.0。1H NMR(300 MHz)δ:7.6～7.5(2H,m, H-6 H-7),4.65(2H,m,H-3),3.17-3.13(2H,t,H-1), 2.27(3H,s,H-18),1.8～1.76(2H,m,H-2),1.66～1.63(2H,m,H-3),1.32(6H,s,H-4)。

化合物C4的合成方法类似C1,所接胺为3,4-二甲氧基苯乙胺,得到橘红色产物,产率25%。经查证为新化合物。EI-MS(m/z):308.2,236.2,189.2 (100),164.1,103.1,76.0,43。1H NMR(300 MHz) δ:7.6～7.5(2H,M,H-6 H-7),6.57(1H,s,H-3’), 6.49(1H,s,H-6’),5.29～5.27(1H,dd,H-7’),3.773 (2H,m,H-1’),3.66(2H,s,H-21),3.18～3.14(2H, T,H-1),1.3～1.22(6H,S,甲氧基-H)。

化合物C5的合成类似C1,所接胺为2-金刚烷胺,得到产物20 mg,产率20%,经查证为新化合物。EIMS(m/z):308.3,265.3,149.1,118.9,84(100), 35.0.1H NMR(300 MHz)δ:7.6～7.5(2H,m,H-6 H-7),3.97(2H,s,H-21)3.18～3.14(2H,t,H-1), 1.77～1.57,1.33～1.29(多H,m,金刚烷胺)。

2.2 细胞抑制率实验结果 运用SPSS12.0版软件对MTT实验测得的各数值进行统计分析,各化合物IC50及IC20值见表1,该部分实验数据采用SPSS12.0版单因素ANOVA方差分析检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 6种化合物对Hela细胞的抑制作用测定结果Tab.1 Inhibitory activity of six compounds against Hela cell μmol·L-1

2.3 MTT评价各化合物辐射增敏活性结果 根据丹参酮ⅡA及其合成衍生物对Hela细胞的抑制作用结果,依据48 h IC20(选取IC20值是因为在该浓度时化合物的细胞毒作用较小,测出的结果能够更有效反映放射增敏作用),选取化合物C2,C4,C5,丹参酮ⅡA (C2A)进行测定。与对照组0 Gy(单纯照射组)比较,计算各孔存活率,结果见表2。

表2 4种化合物不同剂量组照射后细胞存活率测定结果Tab.2 Results of cell surviving rate after irradiation by different doses of four kinds of compounds %

实验表明,化合物C4照射合并给药组对Hela细胞的抑制率显著高于单纯照射组,剂量为1,2,4,6 Gy时分别高出36.23%,25.25%,25.31%,22.98%。

3 讨论

丹参酮ⅡA的A环和D环是结构修饰的两个主要位置,而且通过修饰A,D两个环结构,会破坏分子平面结构,这可能使分子的水溶性增加,相应的活性也增加[4]。笔者在本研究中试图在D环呋喃环上引入空间位阻更大的胺类,实验尝试过引入多种胺类,但部分结果并不是预期得到的产物,胺类并没有加上,得到的主要副产物即16位引入一个羟甲基。类似研究也有同样的结果[6]。这可能是由于所选胺类的空间位阻太大,而且由于位阻作用所得产物的产率都比较低。根据本课题组前期工作及实验室条件,用Hela细胞对合成的化合物进行放射增敏活性测定。生物实验结果表明,总体上所得化合物对Hela均有一定的抑制作用。增敏实验结果表明,与丹参酮ⅡA比较,化合物C4的放射增敏效果较好,这可能是由于C4 16位引入芳香基团的原因。由此推测,在丹参酮ⅡAD环16位引入芳香性侧链可能会增强其放射增敏作用。这为进一步对丹参酮ⅡA进行结构修饰,以专一性提高其放射增敏作用提供了一定依据。

[1] 浦锡娟,徐凯琳.丹参的药理作用研究进展[J].临床医学工程,2009,16(8):154-155.

[2] WANG B Q.Salvia miltiorrhiza:Chemical and pharmacological review of a medicinal plant[J].J Med Plants Res, 2010,4(25):2813-2820.

[3] LIN T H,HSIEH C L.Review pharmacological effects of salvia miltiorrhiza(danshen)on cerebral infarction[J].Chin Med,2010,5:22.

[4] 叶因涛,杨福军,徐文清.丹参酮化合物对Hela细胞抑制作用与构效关系探讨[J].医药导报,2009,28(10): 1261-1264.

[5] 江城锋,李瑞峰,薛丹,等.丹参酮ⅡA结构修饰及其对宫颈癌hela细胞的抑制作用研究[J].天然产物研究与开发,2010,24(3)385-388.

[6] 杨东,罗厚蔚.丹参二萜醌的结构修饰[J].中国药科大学学报,1998,29(4):255-258.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.003

Synthesis of TanshinoneⅡA Derivatives and Their Radiosensitivity Against Hela Cells

LI Guang-qiang,ZHAO Jie,SHEN Xiu,ZHOU Ze-wei,XU Wen-qing
(Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medicine Science,Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Molecular Medicine,Tianjin 300192,China)

Objective Structure modification of TanshinoneⅡA was performed in order to get tanshinone derivatives with higher radiosensitivity.MethodsStructure of TanshinoneⅡA was modified via Mannich reaction by adding different small amines at C16.The structures of the derivatives were confirmed through spectral data of EI-MS and1HNMR.The antiproliferation activities and radiosensitizing activity of TanshinoneⅡA derivatives against Hela cells were evaluated by MTT assay at IC50and IC20.ResultsFive compounds were synthesized,four of which were new.Compound C5 with an aromatic nucleus inserted at C16 had higher radiosensitivity than the prototype drug.ConclusionAdding an aromatic ring at position C16 of TanshinoneⅡA may be a good way for enhancing radiosensitizing activity.

TanshinoneⅡA;Structural modification;Radiosensitizing activity

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0283-04

2013-07-22

2013-08-20

*中国医学科学院放射医学研究所所内探索基金(ST1321)

李光强(1989-),男,山东济南人,硕士,从事药物化学研究。电话:022-85682386 E-mail：vinqiang@163.com。

徐文清,女,天津人,教授,主要研究方向:药物化学。电话:022-85682386,E-mail：xuwenqing@irm-cams.ac.cn。