高效液相色谱法测定叶酸片的含量与有关物质

2014-05-13吴宏富黄卫平刘放

医药导报 2014年3期

关键词：叶酸片量瓶棕色

吴宏富，黄卫平，刘放

(1.浙江省庆元县中医院药剂科，庆元 323800;2.浙江医学高等专科学校，杭州 310053;3.浙江省医学科学院药物研究所，杭州 310013)

高效液相色谱法测定叶酸片的含量与有关物质

吴宏富1，黄卫平2，刘放3

(1.浙江省庆元县中医院药剂科，庆元 323800;2.浙江医学高等专科学校，杭州 310053;3.浙江省医学科学院药物研究所，杭州 310013)

目的建立测定叶酸片含量及有关物质的高效液相色谱(HPLC)法。方法采用Hypersil C18(4.6 mm× 250 mm,5 μm)色谱柱,流动相磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾6.8 g与0.1 mol·L-1氢氧化钾溶液70 mL,加水稀释至800 mL,调节pH至6.3,加甲醇80 mL,用水稀释成1 000 mL为流动相),检测波长254 nm。结果叶酸在19.80～277.24 μg·mL-1浓度范围内,峰面积与浓度呈良好线性关系(r=0.999 9,n=7),平均回收率98.65%～98.95%,RSD= 0.20%～0.60%(n=9)。叶酸及其有关物质得到基线分离,方法最低检测限0.6 ng,控制总杂质量不得超过2.0%。结论该方法测定叶酸片的含量及有关物质,方法简便、快速、结果准确,专属性好,适用于叶酸片及其制剂的质量控制。

叶酸；有关物质；质量控制；色谱法,高效液相,反相

叶酸(folic acid)是一种抗贫血药物,亦称维生素M或维生素BC,与人体重要的生化过程密切相关,直接影响核酸的合成及氨基酸代谢,对细胞分裂、增殖和组织生长具有极其重要的作用,妇女怀孕早期适量增补叶酸可以降低神经管畸形的发生[1]。叶酸已成为一种集预防、治疗和保健于一身的多功能药物而越来越受到重视。有关叶酸分析方法的报道有紫外分光光度法[2]、一阶导数光谱法[3]、流动注射化学发光法[4]以及高效液相色谱法等,其中以高效液相色谱法最常用。为了控制叶酸制剂的质量,笔者者参考有关文献[5-11],建立了高效液相色谱法测定叶酸片的含量和有关物质,现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪;SPD-10A紫外检测器,N-2000双通道色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所,浙江大学智能信息工程有限公司);TU-1800紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),Sartorius BS124S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司),YB-2型澄明度检测仪(天津大学精密仪器厂),SB-2200超声波清洗器(上海必能信超声有限公司),PHS-9V型酸度计(杭州华光无线电厂),101-1型电热鼓风干燥箱(上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司)。

1.2 试药叶酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号:100074-200912,HPLC法测定含量为90.6%,UV法测得含量为91.7%)。叶酸片(北京北大药业有限公司,商品名:斯利安,规格:0.4 mg,批号:S080203, S090413),叶酸片(浙江省医学科学院药物研究所,批号:E00910,E01010,E01110,规格:0.4 mg),甲醇(上海陆都实业有限公司,色谱纯),磷酸二氢钾(上海化学试剂二厂,分析纯),氢氧化钾(浙江杭州萧山化学试剂厂,分析纯),磷酸(建德化工厂,分析纯),水为双蒸馏水(自制)。

2 方法与结果

2.1 叶酸紫外吸收光谱取叶酸对照品约10 mg,置50 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液30 mL,溶解后用水稀释至刻度,摇匀,精密量取1 mL置20 mL棕色量瓶,用水稀释至刻度,摇匀,制成每毫升约含叶酸10 μg的溶液,在波长200～500 nm范围内进行全扫描,结果叶酸在254 nm波长处有最大吸收(图1)。

图1 叶酸紫外吸收光谱

2.2 色谱条件色谱柱:Hypersil C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm),流动相:磷酸盐缓冲液(pH6.3)(取磷酸二氢钾6.8 g与0.1 mol·L-1氢氧化钾溶液70 mL,加水稀释至800 mL溶解,调节pH至6.3,加甲醇80mL,用水稀释成1000mL),流速: 1.0 mL·min-1,检测波长:254 nm,柱温:室温,进样量:20 μL。灵敏度:0.05 AUFS,理论板数以叶酸峰计不得低于2 000。

2.3 含量测定

2.3.1 标准曲线的绘制取叶酸对照品约20 mg精密称定至50 mL棕色量瓶,加入5%氨水30 mL助溶,置热水浴中加热20 min,时时振摇使叶酸溶解,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,即得0.400 mg·mL-1对照品溶液;精密吸取0.5,1.0,2.0,4.0,5.0,6.0和7.0 mL,分别置于7只10 mL棕色量瓶,用水稀释至刻度,摇匀。精密量取10 μL注入液相色谱仪,记录色谱图和峰面积,以叶酸浓度(C,μg·mL-1)对相应峰面积(A)进行线性回归,回归方程为:A=1 986.78C+1 084.47,r=0.999 9(n=7),结果叶酸浓度在19.80～277.24 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.2 加样回收实验分别取叶酸对照品约16,20, 24 mg精密称定置于100 mL棕色量瓶,各3份,按处方比例加入混合辅料,加0.5%氨溶液约60 mL,置热水浴中加热20 min,时时振摇使叶酸溶解,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为样品供试品溶液。另配制含叶酸200 μg·mL-1对照品溶液,精密量取供试品溶液与对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪,记录色谱图和峰面积,按外标法以峰面积计算叶酸加样回收率。结果见表1。

表1 叶酸回收实验结果

2.3.3 重复性实验取本品50片,精密称定,研细,取适量(相当于叶酸5 mg),精密称定置25 mL棕色量瓶(平行操作6份),加0.5%氨溶液约15 mL,置热水浴中加热20 min,时时振摇使叶酸溶解,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液,精密量取10 μL注入液相色谱仪,记录色谱图;另取上述含叶酸200 μg·mL-1对照品溶液,同法测定。按外标法以峰面积计算,结果叶酸平均含量为99.38%,RSD= 0.57%(n=6)。

2.3.4 供试品溶液稳定性取“2.3.3”项供试品溶液,分别于0,1,2,4,8 h,精密量取10 μL注入液相色谱仪,记录色谱图和峰面积,结果样品供试液在8 h内所测得的图谱峰面积的RSD=0.29%(n=5),表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.3.5 样品的含量测定取叶酸2批,按“2.3.3”项操作,制备供试品溶液和对照品溶液,依法测定,结果见表2。

2.4 样品有关物质检查

2.4.1 方法专属性实验取叶酸片50片,精密称定,研细,取适量(相当于叶酸20 mg),精密称定置50 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液约30 mL,置热水浴中加热20 min,时时振摇使叶酸溶解,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液(含叶酸约为400 μg·mL-1)备用。

2.4.1.1 未破坏供试品溶液的制备取上述续滤液5 mL,置10 mL棕色量瓶,用水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液(含叶酸约为200 μg·mL-1)。

2.4.1.2 强酸破坏供试品溶液的制备取上述续滤液5 mL,置10 mL棕色量瓶,加1 mol·L-1盐酸1 mL,放置4 h,再加1 mol·L-1氢氧化钠1 mL中和,用水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液(含叶酸约为200 μg·mL-1)。

2.4.1.3 强碱破坏供试品溶液的制备取上述续滤液5 mL,置10 mL棕色量瓶,加1 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL,放置4 h,再加1 mol·L-1盐酸1 mL中和,用水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液(含叶酸约为200 μg·mL-1)。

2.4.1.4 氧化破坏供试品溶液的制备取上述续滤液5 mL,置10 mL棕色量瓶,加30%过氧化氢,放置1 h,用水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液(含叶酸约为200 μg·mL-1)。

2.4.1.5 高温破坏供试品溶液的制备取叶酸片20片,精密称定,置烘箱中于90℃中放置12 h,取出放冷后,研细,取适量(相当于叶酸5 mg),精密称定置25 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液约15 mL,置热水浴中加热20 min,时时振摇使叶酸溶解,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液(含叶酸约为200 μg·mL-1)。

2.4.1.6 强光破坏供试品溶液的制备取叶酸片20片,精密称定,置澄明度检测仪中,于照度(4 500±500)Lx强光下照射24 h,取出后,研细,取适量(相当于叶酸5 mg),精密称定置25 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液约15 mL,置热水浴中加热20 min,时时振摇使叶酸溶解,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液(含叶酸约为200 μg·mL-1)。

2.4.1.7 混合辅料供试品溶液的制备取混合辅料适量,置25 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液约15 mL,置热水浴中加热20 min,时时振摇使叶酸溶解,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液。

精密量取上述供试品溶液10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。实验结果表明供试品经上述剧烈条件破坏后产生的杂质峰、降解产物峰与叶酸峰均能达到较好的分离,分离度(R)均＞1.5;混合辅料在叶酸主峰位置及附近均不出峰,不干扰分析测定。

2.4.2 定量限与检测限取叶酸对照品约5 mg精密称定,置于25 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液约15 mL,置热水浴中加热20 min,时时振摇使叶酸溶解,放冷,用水稀释至刻度,摇匀。制成浓度为200 μg·mL-1对照品溶液;精密量取1 mL,置10 mL棕色量瓶,用水稀释至刻度,摇匀。制成浓度为20 μg·mL-1的对照品溶液;依次类推制成浓度为0.2和0.06 μg·mL-1的对照品溶液;量取不同体积分别进样,当信噪比(S/N)≥10和S/N≥3时,叶酸定量限为2 ng,检测限为0.6 ng。

2.4.3 样品有关物质的测定采用自身对照法。取“2.3.5”项供试品溶液作为供试品溶液;精密量取供试品溶液1 mL,置50 mL棕色量瓶,用水稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。精密量取对照溶液10 μL注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使对照溶液的主峰高为满量程的20%;再精密量取供试品溶液和对照溶液各10 μL,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰,各杂质峰面积之和不得大于对照溶液的主峰面积(2. 0%),结果见表2。

表2 叶酸片含量和有关物质测定结果 %,n=3

3 讨论

3.1 波长的选择根据“2.1”项实验结果,叶酸在波长254 nm处有最大吸收,与文献[5-7]报道相符,辅料在254 nm波长处没有吸收,故实验采用254 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择采用高效液相色谱法测定叶酸类药物含量的报道较多[5-11],所用流动相有磷酸盐缓冲液(pH6.3)(取磷酸二氢钾6.8 g与0.1 mol·L-1氢氧化钾溶液70 mL,加水稀释至800 mL溶解,调节pH至6.3,加甲醇80 mL,用水稀释成1 000 mL)[5-6],以磷酸二氢钾6.8 g与0.1 mol·L-1氢氧化钾水溶液70 mL,稀释约850 mL,用氢氧化钾稀溶液调节pH至6.3±0.1,加甲醇130 mL,水稀释成1 000 mL的溶液[7],甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液(11∶89, pH5.4)[8],甲醇∶水(含2%醋酸、0.1%辛烷磺酸钠、0.2%乙二胺,25∶75[9],甲醇∶水=30∶70[10],甲醇-水-冰醋酸(40∶60∶0.1)[11]等;参照叶酸片质量标准(《中华人民共和国药典》2010年版二部),本实验采用以磷酸盐缓冲液(pH6.3)(取磷酸二氢钾6.8 g与0.1 mol·L-1氢氧化钾溶液70 mL,加水稀释至800 mL溶解,调节pH至6.3,加甲醇80 mL,用水稀释成1 000 mL)流动相。

3.3 供试品溶液稳定性叶酸在水和酸性条件下具有热不稳定性和光不稳定性,而在稀碱条件下易溶且稳定性好,因此在实验中用0.5%氨溶液溶解样品,且操作过程需要避光。

3.4 方法专属性方法专属性实验显示,本品经酸、碱、氧化、高温、光等破坏实验,产生的杂质峰和降解产物峰均能与主峰达到基线分离,说明该色谱条件可用于叶酸片的有关物质和降解产物的检查。

3.5 方法优点目前,《中华人民共和国药典》2010年版[5]叶酸及其制剂叶酸片质量标准项下尚无有关物质测定方法。笔者在本实验中经过系列方法学研究,采用高效液相色谱法-紫外检测器测定叶酸片的含量和有关物质,方法简便易行,准确度高,专属性好,易于普及,可作为叶酸及其制剂的质量控制方法。

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